蛋白酶结构ppt课件

.,蛋白酶结构,.,蛋白酶的结构和性质1.酸性蛋白酶,主要来源：酸性蛋白酶主要来源于哺乳动物的消化道，如胃蛋白酶；部分微生物是酸性蛋白酶的主要来源，如:目前的商品酸性蛋白酶制剂主要是有黑曲霉发酵生产的。,.,1.酸性蛋白酶,一般性质分子特性：酸性蛋白酶的最适pH在2-5范围，酶蛋白的等电点在pH3-5，分子量MW30000-35000催化特性：酸性蛋白酶的最适温度因来源不同而有差异，一般霉菌的蛋白酶的最适温度较高，大部分在50-60范围，而来源于动物胃黏膜的蛋白酶的最适温度较低，一般在40左右。,.,1.酸性蛋白酶,酸性蛋白酶的热稳定性较差，一般在50都很快失活，此外，酶的热稳定行还受到基质的pH的影响；有酸性蛋白酶不耐低温，在低温条件下，很快失活。许都酸性蛋白酶分子中含有5-10%多糖，对酶的稳定有益,.,2.碱性蛋白酶性能,碱性蛋白酶是经细菌原生质体诱变方法造育的2709枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术，广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果。,.,2.碱性蛋白酶,碱性蛋白酶在技术上采用细菌原生质体诱变处理方法,从国内碱性蛋白菌生产菌2709枯草杆菌中研究选育出若干稳定高性能菌株,在后处理上,采用去渣盐析沉淀法,减少了蛋白酶的杂质含量和产品特有的气味，提高了溶解速度,与洗涤剂有更好的配伍性,延长了保质期。碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。,.,3.中性蛋白酶,分子特性:大部分微生物产生的中性蛋白酶属于金属蛋白酶，一分子酶蛋白含有一个锌原子，酶蛋白的分子量在35000-40000范围，等电点pH8-9,微生物蛋白酶中，中性蛋白酶的稳定性最差，分子之间最容易发生自溶，即使在低温条件下，也会发生明显的自溶，造成分子量明显降低。,.,蛋白酶的制备胰蛋白酶的制备,（1）猪胰蛋白酶原的提取猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于1015搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5MH2SO4调pH至2.53.0，放置34小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5L）。加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。,.,蛋白酶的制备胰蛋白酶的制备,（2）胰蛋白酶原激活向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液。将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1MCaCl2。用5MNaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化810h，（23小时取样一次，并用0.001MHCl稀释），测定酶活性增加的情况。活化完成（比活约35004000BAEE单位）后，用2.5MH2SO4调pH至2.53.0，抽滤除去CaSO4沉淀。,.,蛋白酶的制备胰蛋白酶的制备,（3）胰蛋白酶的分离1.将已激活的胰蛋白酶溶液按242g/L加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。2滤液按250g/L加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。,.,蛋白酶的制备胰蛋白酶的制备,（4）胰蛋白酶的结晶将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0mlpH9.0的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。用2MNaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/41/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。放置25天可得到大量胰蛋白酶结晶，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收。,.,蛋白酶的制备胰蛋白酶的制备,（5）胰蛋白酶的重结晶将第一次结晶的胰蛋白酶产物进行重结晶：用约1倍的0.025MHCl，使上述结晶分散，加入约1.01.5倍体积的pH9.0的0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2MNaOH调溶液pH至8.0（准确）（体积过大，很难结晶），冰箱放置12天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。,.,3.中性蛋白酶,催化特性：中性蛋白酶的热稳定性较差，如枯草杆菌的中性蛋白酶在pH7,60处理15分钟，失活90%；稀土曲霉的中性蛋白酶在pH7,55处理10分钟，失活80%以上；,.,利用酶蛋白的分子修饰技术，研究发现，利用EDTA螯合作用中性蛋