特殊医学用途配方食品中营养物质与风险物质分析

,特医食品中营养与风险物质的分析,LocationofR-biopharm,R-BiopharmGroup德国拜发集团全球知名食品安全检测、饲料分析和临床诊断产品专家提供涵盖各检测领域各类方法的不同类型检测产品ISO认可和实时监控记录，全面保障食品安全检测试剂批间和批内稳定性,维生素（vitamin）是人和动物维持正常的生理功能所需要的一种微量有机物质，人体无法合成，必需从食物中获得。分类:水溶性维生素脂溶性维生素目前无国际统一标准术语:维生素B1Thiamin维生素B2Riboflavin维生素B3VitaminP;Nicotinacid维生素B5Pantothenicacid维生素B6Pyridoxin维生素B7VitaminH,Biotin维生素B9VitaminB11,VitaminM,Folicacid维生素B12Cobalamin,背景介绍,维生素类：维生素A维生素D维生素E维生素K1维生素B1维生素B2维生素B6维生素B12烟酸叶酸泛酸维生素C生物素,特殊医学用途配方食品通则（GB29922-2013）,矿物质类：钠钾铜镁铁锌锰钙磷碘氯硒,可选择性成分：铬钼氟胆碱肌醇牛磺酸左旋肉碱二十二碳六烯酸二十碳四烯酸核苷酸膳食纤维,针对实际的维生素含量，与标签标注的维生素含量的相关法规或条例要求：China中国GB28050-2011预包装食品营养标签通则除维生素A和D之外的其他维生素80%标示值维生素A和维生素D80%180%标示值USFDA强化的维生素的实际含量:100%标签标注量原生的维生素的实际含量:80%标签标注量AssociationofGermanChemists(GDCh德国化学家协会）建议的:+/-20%针对维生素B1,B2,B6,泛酸和烟酸+/-30%针对维生素B12，生物素和叶酸考虑到维生素的不稳定性而在生产时做的过量强化，检测值不应该超过标签标准量的50%。在保质期到期日，产品中的维生素含量还应该符合标签标注量的规定。,预包装特殊膳食用食品标签（GB13432-2013）,能量或营养成分的标示数值可通过产品检测或原料计算获得。在产品保质期内，能量和营养成分的实际含量不应低于标示值得80%，并应符合相应产品标准的要求。,B族维生素类的国标检测方法,叶酸：GB/T5009.211生物素：GB/T5009.259维生素B12：GB5413.14/5009.217泛酸：GB/T5009.210/5413.17肌醇：GB/T5009.270烟酸：GB/T5009.89维生素B6：GB/T5009.154维生素B1：GB/T5009.84维生素B2：GB/T5009.85,GB5413婴幼儿食品和乳品GB5009食品,B族维生素类的国标检测方法,为什么要检测维生素？从法规的角度:审查食品中实际添加的维生素的含量与标签标注的是否一致审查食品中添加的维生素量是否能在食品质保期的最后仍然符合添加和标注要求婴幼儿配方乳品企业获取生产许可证的检测能力要求2013年1月1日正式实施的预包装食品营养标签标准,维生素检测中的难点:许多的维生素都不稳定:光不稳定性热不稳定性易被氧化样品中维生素的含量很低很难做到均匀地分散在样品中数量级不同(g/100g;mg/100g)在贮藏过程中分解,样品多样化（针对不同样品需要使用不同的处理方法）,维生素的Stability（稳定性）和Lability（不稳定性）维生素pH7pH7pH7O2LightHeat生物素SSSSSSB12SSSSLL叶酸LSLLLSB3SSSSSS泛酸SLLSSLB6SSSSLSB2SLSSLSB1LLSLSL,FromAOAC:MethodsfortheMicrobiologicalAnalysisofSelectedNutrientsAgricultureandFoodChemistry(1959)7,94,维生素检测的标准参考方法传统的微生物方法是检测叶酸、生物素、维生素B12、维生素B3和泛酸的ISO标准参考方法1960年建立并沿用至今的AOAC方法为微生物法AOACOfficialMethod960.46欧盟标准方法EN14131:2003:微生物法检测食品中的叶酸欧盟标准方法EN14166:2002:微生物法检测食品中的维生素B6中国国标方法GB5009系列，5413系列：微生物法：肌醇、维生素B3（烟酸）、泛酸、维生素B12、叶酸、生物素；GC法：肌醇；LC法：维生素A、D、E、K1、B1、B2、B3、B6、泛酸。,传统微生物检测方法-生物素（GB5009.259-2016）准备工作：乙醇，NaOH，NaCl，盐酸，柠檬酸盐，淀粉酶，硫酸等溶液的配置；乳酸杆菌培养基制备；菌种储备工作。菌液接种（16-20hrs）生物素标准品的配备（9个梯度+样品空白）样品制备,121，30min灭菌,标准品，样品接种菌液，培养16-24hrs,630nm，分光光度计检测,接种培养基菌种生长杂菌生长菌种和培养基控制过程中易出现各种变化导致实验失败纯度问题每支管分别测量（无微孔板形式）目前，只有极少数实验室进行耗时很长的传统微生物方法检测维生素的操作。,传统微生物方法复杂、不易实施,样品处理:均质，提取，（离心），无菌过滤，稀释针对检测样品中强化的维生素标准品梯度稀释：根据试剂盒中给的表格进行稀释接种：将样品及标准品加入到包埋有标准菌株的微孔板上，再加入培养基（即用型）孵育:44-48h(泛酸24h)37C(B6和肌醇30C)结果计算:2min(4-参数曲线),德国拜发提供的微生物法检测试剂盒检测方法,标准化的试剂盒规格定量的微孔板形式维生素检测试剂盒系列，检测食品、饲料和药品中得水溶性维生素B族含量试剂盒组份:96-孔微孔板及空板架各3瓶培养基、维生素标准品及无菌水3张覆盖膜叶酸试剂盒特有：三瓶缓冲液,Easi-Extract维生素免疫亲和柱，配合HPLCEasi-ExtractVitaminB12RBRP80/80BEasi-ExtractVitaminB12(LGE)RBRP88/88BEasi-ExtractFolicAcidRBRP81/81BEasi-ExtractBiotinRBRP82/82BRIDASCREENELISA,酶联免疫试剂盒（抗原-抗体原理）RIDASCREENFASTFolsure(FolicAcid)叶酸R3202RIDASCREENBiotin生物素R2201RIDASCREENFASTVitaminB12维生素B12R2102酶方法配合分光光度计:维生素C/L-抗坏血酸10409677035,以叶酸检测为例,方法间的比较,针对特膳食品生产企业和相关检测单位：,样品量大，时间紧，需要快速筛查，检测人工添加的维生素，不需微生物实验室RIDASCREENELISA酶联免疫试剂盒符合国标要求，节省人力和时间，结果准确，项目齐全VitaFast微生物法试剂盒国际发展趋势，AOAC官方方法，不需微生物实验室EASI-EXTRACT免疫亲和柱+HPLC,Products,四、维生素检测叶酸（维生素B9）维生素B12生物素（维生素B7)烟酸（维生素B3)泛酸（维生素B5)维生素B6肌醇（维生素B9)维生素A维生素D,AOAC认证,ISO原理,国标原理,特医食品中叶酸、生物素的测定-VitaFast试剂盒法依据,使用试剂盒的依据：“6.8.2测定注2：叶酸测定也可采用预包埋菌种的叶酸测定用试剂盒（微生物法）”“6.6测定注：试样提取液也可采用预先包埋了菌种的微生物法生物素试剂盒测定，效果相当。550nm”,VitaFast（RIDASCREEN）试剂盒法与传统方法的比较,经检测结果表明，德国拜发的试剂盒范围为90-179，传统方法检测范围为94-175，RSD相对差异率范围为1.13-2.78,两种检测方法结果基本一致，符合要求。（VitaFast试剂盒）,测5份样品的结果进行比对，计算差异。RIDASCREENFASTFolicAcid叶酸试剂盒的测定值范围在98216g/100g，传统方法检测范围在74168g/100g，两种方法比较偏差范围在6.218.1%。（RIDASCREEN试剂盒）,VitaFast试剂盒法测定样品中的生物素,经检测结果表明，德国拜发的试剂盒范围为17.5-35.8，传统方法检测范围为17.4-36.6，RSD相对差异率范围为1.9-4.2，两种检测方法结果基本一致，符合要求。,试剂盒的准确度用加标回收实验表明：5个不同类型奶粉样本，每个样本3个平行的回收率范围为90-102%，符合说明书中90-105%的要求；RSD(变异系数%)范围从2.0-4.2%。,VitaFast微生物法维生素检测试剂盒与传统微生物法的比较,原理完全一样，菌种完全一致完全省去了配置培养基、购买和保存菌种、接种等大量耗时且繁琐的工作和费用标准菌种已经固定在微孔板内，以最佳状态等待后续的检测。解决了菌种纯净和稳定的问题检测所需要的所有试剂和操作均已标准化不需要微生物专业背景的操作人员即可上手使用VitaFast试剂盒VitaFast试剂盒方法简单、易学易用VitaFast试剂盒已获得AOAC认证，符合GB、EN和DIN参考方法要求国际验证和数据证明，VitaFast试剂盒的检测结果与参考方法结果一致,特殊医学配方食品通则（GB29922-2013/GB2761-2017）,黄曲霉毒素B1的结构,黄曲霉毒素M1的结构,GB2761-2017中规定：黄曲霉毒素B1按GB5009.22规定的方法测定；黄曲霉毒素M1按GB5009.24规定的方法测定。,最新颁布的真菌毒素系列标准,GB5009.22-2016食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定由国家卫生和计划生育委员会2016年第17号公告发布，发布日期为2016年12月23日，实施日期为2017年6月23日。本标准代替GB/T5009.22-2003、GB/T5009.23-2006、GB/T5009.24-2010、GB/T18979-2003、SN0339-1995、SN/T16642005、SN/T11012002、SN06371997、SN/T17362006、NY/T12862007。GB5009.24-2016食品中黄曲霉毒素M族的测定由国家卫生和计划生育委员会2016年第17号公告发布，发布日期为2016年12月23日，实施日期为2017年6月23日。本标准代替GB5413.372010、GB/T5009.242010、GB/T232122008和SN/T16642005。,GB5009.22-2016食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定,本标准与GB/T5009.222003相比,主要变化如下:标准名称修改为“食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定”；根据GB27612011的要求，增加了方法的适用范围；增加了高效液相色谱-柱前衍生法；增加了高效液相色谱-柱后衍生法；修改了酶联免疫法,并将方法名称更改为酶联免疫吸附筛查法；增加了免疫亲和柱以及酶联免疫试剂盒质量判定要求与方法；修改了测定组分为黄曲霉毒素B族和G族化合物。,GB5009.22-2016食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定,特医食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定,原则：满足GB5009.22-2016中黄曲霉毒素B1的定量限（0.1g/kg）要求；满足检测的准确性与安全性；检测的成本与时效性；保障实验人员的安全性。因此，选用免疫亲和-柱后电化学衍生高效液相荧光法作为特医中黄曲霉毒素B1检测的首选方法。,GB5009.24-2016食品中黄曲霉毒素M族的测定,本标准与GB5413.372010相比,主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定”；增加了方法适用范围；增加了对黄曲霉毒素M2的检测；修改了酶联免疫法，并修改第三法名称为酶联免疫吸附筛查法；修改了液相色谱-质谱联用法；修改了液相色谱法的前处理方法；删除了免疫层析净化荧光分光度法。,GB5009.24-2016食品中黄曲霉毒素M族的测定,传统离线免疫亲和柱+柱后电化学衍生高效液相色谱荧光法,色谱柱：SupelcoLC-18（150mm4.6mm，5m）；流动相：水/甲醇/乙腈（64/25/12，V/V/V），含0.12g/L溴化钾和100L/L浓硝酸；流速：1.8mL/min；柱温：27；进样体积：100L；电化学衍生：100A；检测条件：荧光检测器，激发波长：360nm，发射波长：430nm；运行时间：10min。,前处理,液相条件,传统离线免疫亲和柱+柱后电化学衍生高效液相色谱荧光法,AFTB1,AFTG2,AFTG1,AFTB2,电化学衍生法验证报告,柱后电化学衍生法是在电流的作用下，溴化钾与AFTB1和AFTG1双呋喃环上的双键发生加成反应，生成荧光强度更强的溴化物形式，从而提高AFTB1和AFTG1灵敏度。,传统离线免疫亲和柱+高效液相色谱荧光法,色谱柱：SupelcoLC-18（150mm4.6mm，5m）；流动相：水/甲醇/乙腈（64/25/12，V/V/V），含0.12g/L溴化钾和100L/L浓硝酸；流速：1.0mL/min；柱温：27；进样体积：100L；检测条件：荧光检测器，激发波长：360nm，发射波长：430nm；运行时间：10min。,前处理,液相条件,传统离线免疫亲和柱+高效液相色谱荧光法,AFTM1,AFTM2,传统离线免疫亲和柱+高效液相色谱荧光法,5样品/30min,5样品/120min,HPLC进样分析,5样品/80min,全自动（在线）免疫亲和固相萃取技术,黄曲霉毒素B族和G族,黄曲霉毒素M族,RIDACRESTSystem,容量2x48瓶样品盘2x浅孔MTPs(96)样品稳定性4安全自动化体积和流速循环模式,IMMUNOPREPONLINE产品描述,在线免疫亲和柱中特有的亲水聚合载体上连接有特异性单克隆抗体。IMMUNOPREPONLINE在线免疫亲和柱系列可以在RIDACRESTHPLC全自动在线免疫亲和柱处理器的应用平台上实现真正的全自动检测。,RIDACREST运行模式,LCmode（经过处理的纯净样品）：StandardXLCmode（未经处理的粗提样品）：PeakFocusingElutionmode（未经处理的粗提样品）：,RIDACRESTTechnologyToday,CurrentStateofTechnology,RIDACRESTSystem,容量2x48瓶样品盘2x浅孔MTPs(96)样品稳定性4安全自动化体积和流速循环模式,LCmode,StandardXLCelution,Peakfocusing-HPDelution,SampleX,SampleX+1,ZeroExtractiontime,黄曲霉毒素B族与G族-在线SPE方法及液相参数,SPEmethodCartridge:IMMUNOPREPONLINEAFLATOXIN,LCmethod,色谱柱：C18,4.6mmX150mm5m进样体积:1.0mL流动相A:62/26/12Water/MeOH/ACN流动相B:90/10Methanol/Water衍生：KOBRACell电化学衍生Ex:360nm,Em:430nm,液相色谱图,重现性,标准曲线,配置：RIDACREST+Q-Exative质谱,液相质