流式细胞分析分选原理

流式细胞仪工作原理,流式细胞术的原理,流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。,流式细胞仪与显微镜,基本原理,流路流动室鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*1051*106个/ml光路光源检测信号光电倍增管PMTHV电路放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计：计算机,流式细胞仪,光路,流路,电子,软件,流路,光路,电路/电子,软件,流路,单细胞悬液大多数仪器是在50-300m大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程,成为流体动力学聚焦,FLOWCELL,流路,光路,电路/电子,软件,光路,光源检测信号散射光信号FS:前向角散射光SS:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片颜色补偿,光路,光源与通过的细胞聚焦在同一点上激光空冷488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,水冷Innova300系列Innova70系列固态,检测信号,散射光信号前向散射光(FS),FS-Forward(AngelLight)Scatter在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器FS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小,前向散射光,散射光信号侧向散射光,SS-Side(AngelLight)Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器SS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少,核质比,侧向散射光,90DegreeScatter,0,200,400,600,800,1000,8,15,20,30,40,50,100,200,1000,Lymphocytes,Monocytes,Neutrophils,SideScatterProjection,LightScatterGating,Scale,光路-荧光信号,每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION),Fluorescenceemittedbyeachfluorochromeisusuallydetectedinauniquefluorescencechannel.Thespecificityofdetectioniscontrolledbythewavelengthselectivityofopticalfiltersandmirrors.,Absorptionspectrum:Rangeoverwhichafluorescencecompoundmaybeexcited,Emissionspectrum:Rangeofemittedwavelengthsforaparticularcompound,5ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7,4ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5,常用荧光染料的特性,荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488755免疫荧光深红PerCP488670APC633670,光路-滤片特性,当以45o角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter),标准带通滤片bandpass,光源,通过的光谱,630/30nmBP,615-645nmlight,Sourcelight,Passedlight,Certaincolorsabsorbed,Absorbancefilter,488DL,488BK,550DL,525BP,600DL,575BP,640DL,620BP,675BP,Unique4-ColorSingleLaserDesign,PC7,WithThankstoDr.FrankSchniedersGentherapieGruppeAbteilungMolekulareZellbiologieInstitutfrMedizinischeBiochemieundMolekularbiologieUniversittsklinikumHamburg-Eppendorf,EGFP,EYFPand7-AADWithEPICSXLTMandEXPO32TMADC-Software,HEK293HumanEmbryonalKidneyCells293,FilterSetBP510LAF21BP550LAF30DichroicMirror525DRLP,CellViabilitywith7-AAD,HEK293-cellswithEYFPTransfection,HEK293-cellswithEGFPTransfection,MixtureofEGFP-andEYFP-transfectedHEK293-CellsEGFP.EnhancedGreenFluorescentProtein(Ex488;Em507nm)EYFP.EnhancedYellowFluorescentProtein(Ex513;Em527nm)7-AAD.7-Aminoactinomycin(ViabilityStain;Ex546;Em647nm),颜色补偿,减法颜色补偿,减法补偿去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误BDFACSCalibur补偿试剂,全矩阵颜色补偿,全矩阵在每个PMT上对于每一个荧光计算“叠加荧光素”的比率通过矩阵去除或加上信号EPICSXLCytomicsFC500Gallios/Navios,CD45-ECD,流路,光路,电路/电子,软件,电路及电子系统-光电倍增管,Photomultipliertube(PMT)将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号,不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程,单参数直方图,流路,光路,电路/电子,软件,软件,基于Windows平台软件界面简单，易学易用目前流式获取和分析最友好的软件包，涵盖所有数据和图形处理功能易于与医院内LIS系统相连直观拖拽方式调节电压、补偿，支持时时/自动/脱机补偿支持多文件分析报告，内置FlowPage功能，方便中文临床报告的生成和输出PRISM浓缩柱形图功能便于结果统计，兼容Office，支持PDF内置质控功能,Quickset直观的电压调节,QuickComp直观的补偿调节,补偿前,补偿后,PRISM浓缩柱形图,一张图上显示多达1024个表型组合结果（十色分析，210分析组合）将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上能直接读出各种阴性或阳性组合的结果清晰直观且便于数据的保存,直接