课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段（PCR）,课题目标,体验PCR分子学实验方法理解原理讨论PCR的应用,重点难点,PCR技术的的原理PCR的基本操作,温故知新1,组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？,（一）DNA分子的结构,C、H、O、N、P,1.元素组成：,脱氧核苷酸,2.基本单位:,一、基础知识,脱氧核苷酸链结构简图,磷酸二酯键,连接,5，端（含磷酸基团）,3，端（含羟基）,3，端,5，端,-OH末端为3端;磷酸基团的末端为5端,3、DNA单链两端的命名,DNA分子是有条链组成，盘旋成结构。交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；排列在内侧。碱基通过连接成碱基对，并遵循原则。,反向平行,双螺旋,脱氧核糖和磷酸,碱基对,氢键,碱基互补配对,2,(A-T,G-C),4、DNA的空间结构,（即一条链为35，另一条链为53）,沃森和克里克构建了DNA双螺旋结构模型,DNA分子的复制需要哪些条件？,DNA分子的复制过程是怎样的？,温故知新2,DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,（二）DNA分子的复制,1、条件,2、DNA的合成方向：,从子链由5端向3端延伸。,注意：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。,分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程,美国科学家穆利斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术,1993年诺贝尔奖,（三）PCR技术,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,1.PCR原理：,（2）变性的目的：,（3）复性的目的：,解开双链,有利于引物与单链的结合,利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。,（1）原理：,DNA分子的热变性原理:,解旋酶,DNA母链,4种脱氧核苷酸,DNA聚合酶,引物（RNA）,打开DNA双链,模板,合成子链原料,催化子链合成,使DNA聚合酶能从引物3端开始连接脱氧核苷酸,体外扩增DNA如何提供相似环境？,变性（80-100）,耐热的DNA聚合酶,2030个核苷酸构成单链DNA或RNA,缓冲溶液：维持反应的pH值不变,体内DNA复制,PCR,2、PCR的反应条件,3、PCR的反应过程,（1）变性：,（2）复性：,（3）延伸：,循环,升高温度到90以上,DNA解聚为单链,温度降到50左右,两种引物与两条单链DNA结合,升温度升到72左右,在热稳定的DNA聚合酶的作用下用溶液中的脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新DNA链,结果：,处于两个引物之间的DNA序列，呈指数式扩增。,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸,第一个循环,5,3,3,5,引物1,引物2,第二个循环,第一个循环产物,第二个循环产物,（一)实验操作：,1.准备好PCR反应体系的配方,2.用微量移液器按配方往微量离心管中加入各组分,4.离心10s,5.将离心管放入PCR仪上,设置好循环程序进行反应,二、实验操作,注意：,盖严目的：防止实验中脱落或液体外溢轻轻弹击管壁目的：使反应液混合均匀离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。,3.盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液,微量移液器,微量离心管,PCR仪,【思考】为何预变性需要时间稍长？,以便增加大分子模版DNA彻底变性的概率。,（二)操作提示,1.PCR技术高度灵敏，为了避免等因素的污染，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行；,2.分装试剂，所用试剂在，使用时，放在冰块上。,3.简化操作程序，使用一次性枪头。,二、实验操作,高压蒸汽灭菌,外源DNA,-20储存,缓慢融化,50倍,波长260nm处读数,蒸馏水做对照,三、结果分析与评价,-DNA含量的测定,1.测定的原理：,DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。,2.过程：,稀释：,对照调零：,比色测定：,计算：,DNA含量(g/mL)50 x(260nm的读数)x稀释倍数,PCR的优点：,快速、高效、灵活、易于操作,四、课题延伸,比色杯,50：1g/mL的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02,课堂小结,1.关于PCR技术的应用，错误的一项是()A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定,D,2、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的目的是。,防止外源DNA污染,高压蒸汽灭菌,利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为。在第轮循环产