抗体的人工制备

章节安排,第一节多克隆抗体,第二节单克隆抗体,第三节基因工程抗体,第四节催化抗体,目的与要求1、掌握单克隆抗体和多克隆抗体的概念、制备原理及其制备的具体过程。2、了解基因工程抗体与催化抗体的概念及意义。难点与重点重点与难点：单克隆抗体和多克隆抗体的概念、制备原理及其制备的具体过程。,为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。目前，根据制备的原理和方法可分为四类：多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体催化抗体,大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体：多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。,第1节多克隆抗体,一、概念,二、多克隆抗体制备的基本过程,试血测定抗体效价,血清的分离与保存,多抗的纯化与标记多抗的亲和层析,抗体的保存,缓冲体系,防腐剂,稳定剂,浓度,存储时间,（多头加样枪）排枪,ELISA板,96孔细胞培养板,第二节单克隆抗体,一、单克隆抗体的概念,1、概念：由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。2、特点：抗体的重链、轻链及其V区独特型的特异性、亲和力、生物学性状及分子结构均完全相同。,这种杂交瘤细胞：既具有骨髓瘤细胞能大量无限生长繁殖的特性，又具有抗体形成细胞合成和分泌抗体的能力。,10:1,杂交瘤细胞一般采用HAT选择培养基进行初筛，培养基中加入次黄嘌呤（Hypoxanthine，H）、氨基喋呤（Aminoopterin，A）及胸腺嘧啶（Thymidine，T），利用A阻断核酸的主要生物合成途径。代谢缺陷型细胞株缺失旁路DNA合成所需的酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶（HGPRT），不能利用外源性的核苷酸前体，如H和T，丧失DNA合成的旁路途径；只能通过以叶酸为媒介，由氨基酸和其它小分子化合物合成核苷酸进行DNA合成。一旦叶酸衍生物的合成被HAT培养液中的A阻断，这些细胞因为失去DNA合成的主通道，又无能力从旁路合成DNA而死亡。正常细胞在H和T存在的情况下，可利用旁路途径继续合成核酸。小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞株为代谢缺陷型细胞株，融合后在HAT培养基中不能生长，而融合细胞由于含有来自正常细胞的HGPRT酶，在HAT培养基中可以存活。,单克隆抗体的制备过程：,在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。,在用HAT选择培养12d内，将有大量瘤细胞死亡，34d后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持710d后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每23d换一半培养液。,单克隆抗体的制备过程：,（1）天然抗原的制备；（2）免疫动物的确定、免疫剂量及免疫次数的确定；（3）骨髓瘤细胞的准备；（4）小鼠采血测定抗体效价；（5）小鼠脾细胞的制备及饲养细胞的制备；（6）小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合；（7）阳性杂交瘤细胞的筛选；（8）抗体的筛选；（9）阳性杂交瘤细胞腹腔注射小鼠，大量制备单克隆抗体。,单克隆抗体的制备过程：,在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞（Feedercells）。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。,饲养细胞,细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化,饲养细胞：腹腔巨噬细胞或脾细胞,免疫脾细胞-浆母细胞，处于增殖状态的B细胞。浆母细胞又称原浆细胞，为未成熟的浆细胞前体。浆细胞：能够合成和分泌免疫球蛋白的终末分化阶段的B细胞。正常机体浆细胞存在在脾、淋巴结的相应组织结构处。,B淋巴细胞的增殖分化：,原B细胞前B细胞不成熟B细胞成熟B细胞,出现膜型IgM,出现IgM，IgD,在骨髓中：,抗原刺激,浆母细胞（免疫脾细胞）,浆细胞，存在时间短，2-3d,分泌抗体,记忆型B细胞，表达膜型Ig，存活几周或几个月,抗原刺激,较高水平免疫应答,高亲和力识别抗原,抗原刺激,更高亲和力,注意免疫学相关知识：,1、免疫小鼠的日龄及性别：SPFBalb/c小鼠，612周龄，体重为1822g，雌性（便于操作），分成3组，每组4只。2、免疫程序：一免，二免（15d），三免(29d)。3、免疫方式：体内免疫：免疫原性强、来源充分的抗原体外免疫：免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原。,体外免疫：将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法：取48周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤23次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原0.55ug/ml，细胞抗原105106个细胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液；375%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。,4、免疫途径：最常用腹腔多点注射。常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者。5、免疫佐剂：首免，弗氏完全佐剂（油包水的乳浊液，含有结合分枝杆菌的细胞壁成分）；等体积二免、三免，弗氏不完全佐剂（不含结合分枝杆菌）。等体积,注意免疫学相关知识：,腹腔注射,3、优点（1）制备时不需纯化抗原就可得到纯抗体；（2）有很高的效价（3）有高度的单一性、均一性；（4）产量高，且可连续生产。,5、单克隆抗体的应用（1）诊断试剂：用于各种病原体以及肿瘤的诊断。避免了多克隆抗体的交叉反应（2）治疗试剂：兽医临床上传染病的治疗；医学临床上抑制器官移植排斥、治疗自身免疫疾病、制备生物导弹。（3）检测试剂：各种病原体毒力因子的检测；各种免疫细胞及其它组织细胞表面分子的检测。（4）抗原纯化：利用单克隆抗体的特异性，可将单克隆抗体与琼脂糖等偶联制成亲和层析柱，可从混合组分中提取某种抗原成分。制备疫苗,“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物、酶或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。,自1975年单克隆抗体杂交瘤技术问世以来，单克隆抗体在医学中被广泛地应用于疾病的诊断及治疗。但目前绝大数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。因此，医学临床上最理想的单克隆抗体应是人源的,但人-人杂交瘤技术目前尚未突破。,第三节基因工程抗体,目前较好的解决办法是能研制基因工程抗体，以代替鼠源单克隆抗体用于临床。基因工程抗体兴起于80年代早期，是利用DNA重组技术，在分子水平对抗体基因进行切割、拼接或修饰，或人工合成后导入受体细胞表达，从而产生的新型抗体，也称为第三代抗体。,研究成功的基因工程抗体有：嵌合抗体、重构抗体、小分子抗体等。,一、概念,利用基因工程技术制备的抗体分子。,按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构(如Fc片段)，从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷(如鼠源单克隆抗体在人体内使用会引起抗体产生而降低其效果，Fc片段的无效性和副作用)，更具有广阔的应用前景。,二、特点,嵌合抗体(chimericantibody)是指在同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体，又称杂种抗体。,重构抗体：将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因中，再将此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗体。,单链抗体(single-chainantibody)又称Fv分子，由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物(1inker)连接而成。,噬菌体抗体：将抗体可变区基因与编码噬菌体外壳蛋白的基因融合而成的一种基因工程抗体。,催化抗体(catalyticantibody)：也叫抗体酶(abzyme)，是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性。,第四节催化抗体,一、催化抗体的概念,催化抗体(catalyticantibody)也叫抗体酶(abzyme)，是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性。,抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在的高效的催化剂，对生物学、化学和医药等多种学科有重要的理论意义和实用价值。,二、催化抗体的制备,目前，催化抗体的制备采用化学和免疫相结合的方法，首先模拟酶作用于底物时的过渡态结构，化学合成相应的类似物，即半抗原，用以免疫动物，再用单克隆技术，筛选获得单克隆抗体。,对催化抗体的研究，开创了一条人工设计酶的新途径，为寻找新型、高效、高选择性催化剂创造了条件。,1、细胞融合法首先通过化学反应合成反应物的过渡态类似物（通常是半抗原），经与载体蛋白偶联，制成抗原免疫BALBc小鼠，应用B细胞杂交瘤技术研制针对该过渡态类似物的特异性单抗，亦即抗体酶。这种单抗与反应物的过渡态结合降低了反应的活化能，从而加速该反应的进行。,2、抗体结合位点化学修饰法抗体酶和酶一样可用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法