南师大细胞生物学-考研课件-第11章+细胞增殖与调控

第十一章细胞增殖及其调控,细胞增殖(cellproliferation)的意义,细胞增殖(cellproliferation)是细胞生命活动的重要特征之一，是生物繁育的基础。单细胞生物的细胞增殖导致生物个体数量的增加。多细胞生物由一个单细胞(受精卵)分裂发育而来，细胞增殖是多细胞生物繁殖基础。成体生物仍然需要细胞增殖，主要取代衰老死亡的细胞，维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等，都要依赖细胞增殖。,细胞增殖是生命的基本特征，种族繁衍、个体发育、机体修复等都离不开细胞增殖。初生婴儿有1012个细胞，成人有1014个细胞，约200种类型。成人体内每秒钟有数百万新细胞产生，以补偿衰老和死亡的细胞。一个大肠杆菌若按20分钟分裂一次，并保持这一速度，则两天即可超过地球的重量。,第一节细胞周期与细胞分裂,一、细胞周期概述1.细胞周期的定义：细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分完成所经历的一个有序过程，其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细胞。,（一）、细胞周期,2.由G1期、S期、G2期、M期组成：G1期(gap1)：指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间。S期(synthesisphase)：指DNA复制的时期。G2期(gap2)：指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间。Mphase：又称D期(mitosisordivision)，有丝分裂期(Mitosis)，和胞质分裂期(Cytokinesis)。G0期：暂时脱离细胞周期，不进行细胞增殖的休眠细胞。,细胞沿着G1SG2MG1周期性运转，在间期细胞体积增大(生长)；在M期细胞，先是核分裂，接着胞质分裂，完成一个细胞周期。,EukaryoticCellCycle,Atypicalmammaliancellhasacellcycletimeof24hours,with12hrG1,6-8hrS,3-4hrG2,and1hrM.,3.细胞周期时间,不同细胞的细胞周期时间差异很大：S+G2+M的时间变化教小，细胞周期时间长短主要差别在G1期有些分裂增殖的细胞缺乏G1、G2期,4.根据增殖状况，细胞分成三类,从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：连续分裂细胞(cyclingcell)，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。休眠细胞(G0细胞)：休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。终末分化细胞：指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等。G0期细胞和终末分化细胞的界限有时难以划分，有的细胞过去认为属于终末分化细胞，目前可能被认为是G0期细胞。,二、细胞周期时相及其主要事件,ExperimentaldemonstrationofthecoordinatedsynthesisofDNAandhistones.,1.G1期,DNA复制与组蛋白合成同步，组成核小体串珠结构S期DNA合成不同步,2.S期,与DNA合成启动相关，开始合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA、碳水化合物、脂等，同时染色质去凝集。,3.G2期,DNA复制完成，在G2期合成一定数量的蛋白质和RNA分子。,4.M期,M期即细胞分裂期，真核细胞的细胞分裂主要包括两种方式，即有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)。遗传物质和细胞内其他物质分配给子细胞。,三、细胞周期时间的测定,细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关。通常G1期持续时间差异较大，M期最短约0.54.5小时。1.脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法（percentagelabeledmitoses，PLM）：对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为3H或者14C标记的TdR。,测定原理待测细胞经3H-TdR标记后，所有S期细胞均被标记。S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最后阶段的细胞，已渡过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高点的时候说明来自处于S最后阶段的细胞，已完成M，进入G1期。所以从开始出现M到PLM达到最高点（100%）的时间间隔就是TM。当PLM开始下降时，表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期，所以出现LM到PLM又开始下降的一段时间等于TS。从LM出现到下一次LM出现的时间间隔就等于TC，根据TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。事实上由于一个细胞群体中TC和各时相不尽相同，第一个峰常达不到100%，以后的峰会发生衰减，PLM不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM,2.流式细胞仪测定法(FlowCytometry)3.缩时摄像技术可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和分裂期的准确时间。,流式细胞仪测定法,细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化。1.自然同步化多核体：如：粘菌的变形体plasmodia（细胞核达108/Cell）、疟原虫。某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。,四、细胞周期同步化,受精卵早期卵裂,2.人工同步化,（1）、选择同步化有丝分裂选择法：用于单层贴壁生长细胞。M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%）。细胞沉降分离法：根据不同时期的细胞在体积和重量上存在差别进行分离。M期细胞体积大，可用离心分离。优点：可用于任何悬浮培养的细胞。方法简单省时，效率高，成本低。缺点：同步化程度较低，对大多数种类的细胞并不适用。,3、诱导同步化（药物诱导法）（1）DNA合成阻断法G1/S-TdR双阻断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TdR（Hela2mol/L；CHO7.5mol/L），S期细胞被抑制，停在G1/S交界处。移去TdR，释放时间大于TS时，再次加入过量TdR，最终将细胞群阻断于G1/S交界处。优点：同步化程度高，几乎适合于所有体外培养的细胞体系。缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。（2）中期阻断法通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。如:秋水仙素和nocodazole等。优点：操作简便，效率高，无非均衡生长现象。缺点：这些药物的毒性相对较大，可逆性较差。,在培养的细胞中加入过量的TdR（2-2.5mmol/L)引起细胞中dTTP,dATP和dGTP库存分别增加约25、10和2倍，dTTP反馈抑制二磷酸核苷还原酶的活性，最终导致DNA合成的抑制。,4.条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用：将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。,五、特异的细胞周期,特异的细胞周期是指那些特殊的细胞所具有的与标准的细胞周期相比有着鲜明特点的细胞周期。爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期酵母细胞的细胞周期植物细胞的细胞周期细菌的细胞周期,1.爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期,细胞分裂快，无G1期，G2期非常短，S期也短(所有复制子都激活)，以至认为仅含有S期和M期。无需临时合成其它物质。子细胞在G1、G2期并不生长，越分裂体积越小。细胞周期调控因子和调节机制与一般体细胞标准的细胞周期基本是一致的。,2.酵母细胞的细胞周期,酵母细胞的细胞周期与标准细胞周期在时相和调控方面相似。酵母细胞周期明显特点：酵母细胞周期持续时间较短；封闭式细胞分裂，即细胞分裂时核膜不解聚；纺锤体位于细胞核内；在一定环境下，也进行有性繁殖。,3.植物细胞的细胞周期,植物细胞的细胞周期与动物细胞的标准细胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四个时期。目前认为植物细胞不含中心体，但在细胞分裂时可以正常组装纺锤体。植物细胞以形成中板的形式进行胞质分裂。,4.细菌的细胞周期,慢生长细菌细胞周期过程与真核细胞周期过程有一定相似之处，其DNA复制之前的准备时间与G1期类似，分裂之前的准备时间与G2期类似。再加上S期和M期，细菌的细胞周期也基本具备四个时期。细菌在快速生长情况下，如何协调快速分裂和最基本的DNA复制速度之间的矛盾。,（二）、有丝分裂,一、有丝分裂过程*注意G2期末中期前，极性动粒微管组装动态变化。作用于后期的姐妹染色单体分离的几种牵引力及模式解释有关chromosome运动的分子机制行走蛋白类动力蛋白马达分子动粒向两极滑行拉动chromosome向两极滑行,细胞分裂的类型无丝分裂(amitosis)：又称直接分裂，由Remark（1841）发现于鸡胚血细胞，不涉及纺锤体形成及染色体变化。有丝分裂(mitosis)：又称为间接分裂，由Fleming(1882)年首次发现于动物，Strasburger(1880)发现于植物。减数分裂(meiosis）：染色体复制一次，细胞连续分裂两次。,1.前期染色质凝缩；细胞骨架解聚，分裂极确立，纺锤体(spindle)开始装配；核膜消失，核仁解体；Golgi体、ER等细胞器解体，形成小的膜泡。,前期两个中心体向两极移动,此时的染色体由两条染色单体(chromatid)构成。在前期末，染色体主缢痕部位形成一种蛋白复合物称为动粒(kinetochore)。,前中期(prometaphase)核膜解体至染色体排列到赤道面(equatorialplane)上。,核膜破裂成小的膜泡，这一过程是由核纤层蛋白中特异的Ser残基磷酸化导致核纤层解体。,纺锤体微管与染色体的动粒结合，捕捉住染色体。每个已复制的染色体有两个动粒，朝相反方向，保证与两极的微管结合；纺锤体微管捕捉住染色体后，形成三种类型的微管。不断运动的染色体开始移向赤道板，细胞周期也由前中期逐渐向中期运转。,中期(metaphase)染色体排列到赤道面上(MetaphasePlate)上，标志着细胞分裂已进入中期。,是什么机制确保染色体正确排列在赤道板上？,后期(anaphase)指妹妹染色体单体分开并移向两极的时期，分为后期A和后期B两个过程。,排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生向两极运动。后期(anaphase)大致可以划分为连续的两个阶段，即后期A和后期B。后期A，动粒微管去装配变短，染色体产生两极运动。后期B，极间微管长度增加，两极之间的距离逐渐拉长，介导染色体向两极运动。,后期姊妹染色单体分离,末期(telophase)从子染色体到达两极，至形成两个新细胞为止的时期。涉及子核的形成和胞质分裂两个方面。,染色单体到达两极，即进入了末期(telophase)，到达两极的染色单体开始去浓缩。核膜开始重新组装。Golgi体和ER重新形成并生长。核仁也开始重新组装，RNA合成功能逐渐恢复，有丝分裂结束。,末期子核的形成，大体经历了与前期相反的过程，即染色体解聚缩，核仁出现和核膜重新形成。核纤肽B去磷酸化，介导核膜重新装配。,6.胞质分裂(Cytokinesis),核分裂与胞质分裂（cytokinesis）是相继发生的，属于两个分离的过程，如：大多数昆虫的卵，核可进行多次分裂而无胞质分裂，某些藻类的多核细胞可长达数尺，以后胞质才分裂形成单核细胞。,分裂沟的确定：,（1）、动物细胞胞质分裂,胞质分裂(cytokinesis)开始于细胞分裂后期，在赤道板周围细胞表面下陷，形成环形缢缩，称为分裂沟(furrow)。分裂沟的位置与纺锤体极性微管和钙离子浓度升高的变化有关。,收缩环：动物细胞的胞质分裂通过胞质收缩环的收缩实现。胞质分裂开始时，大量平行排列的肌动蛋白和肌球蛋白在中体处组装成微丝并相互组成微丝束，环绕细胞，称为收缩环(contractilering)。收缩环收缩、收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞。,用细胞松弛素处理这一时期的细胞，会出现什么现象？,（2）、植物细胞胞质分裂,植物细胞胞质分裂是因为在细胞内形成新的细胞膜和细胞壁而将细胞分开。植物细胞末期近两极处纺锤丝消失，中间微管保留，并数量增加，形成成膜体。来自高尔基体囊泡沿微管转运到成膜体中间。融合形成细胞板(cellplate)，囊泡的内含物形成初生壁和中胶层，囊泡膜形成质膜，融合留下的管道形成胞间连丝。,特征：有丝分裂纺锤体微管组成：连续MT，幼粒MT，质间微管,二、有丝分裂器,（1）中心粒复制时期：间期动物细胞含一个MTOC，即中心体，在S期末，两个中心粒在各自垂直的方向复制出一个中心粒，形成两个中心体。当前期开始时，2个中心体移向细胞两极，并同时组织微管生长（星体微管、纺锤体微管）。两对中心粒之间形成纺锤体微管，通过微管结合蛋白在正极末端相连。核膜解体时，中心粒已到达两极，并形成纺锤体。,1.中心体,Twocentrosomes,andtheirformingradialarraysofastralmicrotubulesseparatingonthesurfaceofanearlyprophasenewlungcellnucleus.,图片来自/,（2）、中心体周期性,动粒：又称着丝粒。板状三层结构：外层、中层、内层着丝粒结构域：动粒结构域，中心结构域，配对结构域。有两种蛋白：内着丝粒蛋白INCENP，染色体连接蛋白Clips。,2.动粒(kinetochore)与着丝粒(centromere),3.纺锤体,纺锤体有二种微管结构：极体微管(polarmt)两极间的微管，在纺锤体中部重叠，重叠部位结合有分子马达。着丝点微管(kinetochoremt)，是从着丝点到另一极的微管。纺锤体二端为星体。植物没有中心粒和星体，其纺锤体称无星纺锤体。,三、染色体运动的动力机制,染色体列队,动粒微管与着丝点的识别：,染色体向赤道板的运动（前中期中期）,MTbehaviorduringformationofthemetaphaseplate.Initially,MTfromoppositepolesaredifferentinlength.,Experimentaldemonstrationoftheimportanceofmechanicaltensioninmetaphasecheckpointcontrol.,2.染色体向二极的运动（中期后期）,2.染色体向二极的运动（中期后期）,后期B,后期A,MicrotubulesandMotorsinthespindle,67,纺锤体微管滑动假说,四、减数分裂(Meiosis),减数分裂概念与过程减数分裂的意义减数分裂特点脊椎动物配子发生过程,减数分裂概念与过程,概念：减数分裂是细胞仅进行一次DNA复制，随后进行两次分裂，染色体数目减半的一种特殊的有丝分裂。两次分裂分别称为减数分裂期和减数分裂期。,减数分裂的主要类型,配子减数分裂(gameticmeiosis)，或称终端减数分裂(terminalmeiosis)；合子减数分裂(zygoticmeiosis)，或称始端减数分裂(initialmeiosis)；孢子减数分裂(sporicmeiosis)，或称中间减数分裂(intermediatemeiosis)。,MEIOSIS(减数分裂过程),减数分裂的意义,确保世代间遗传的稳定性；增加变异机会，确保生物的多样性，增强生物适应环境变化的能力。减数分裂是生物有性生殖的基础，是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要基础保证。,减数分裂特点,-遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两次，导致染色体数目减半；-S期持续时间较长；-同源染色体在减数分裂期I(MeiosisI)发生配对联会和基因重组；减数分裂同源染色体配对排列在中期板上，第一次分裂时，同源染色体分开。,减数分裂前的间期-S期持续的时间较长-DNA并非完全复制-染色质多凝集为异染色质-G2期长短变化较大,减数分裂前S期与有丝分裂前S期长度比较,MeiosisI,第一次减数分裂的两个特点：-一对复制了的同源染色体分开，分别进入两个子细胞，同源染色体分开之前通常要发生交换重组。-在染色体组中，同源染色体的分离是随机的，同源染色体组要发生重新组合。,前期-减数分裂前期I分为细线期，偶线期，粗线期，双线期，终变期共五个阶段；-形成联会复合体(SynaptonemalComplex,SC)；-同源染色体间遗传物质重组，产生新的基因组合。,减数分裂前期,减数分裂的前期I,79,StagesoftheprophaseofmeiosisIMicrographsillustratingthemorphologyofchromosomesofthelily.,细线期：-染色体呈细线状，染色单体的臂不分离；-染色体上出现染色粒；-染色体端粒通过接触斑与核膜相连（又称花束期，bouquetstage）。合线期：-同源染色体配对（联会，synapsis），形成联会复合体(synaptonemalcomplex,SC)；（二价体和四分体的概念）-合成zygDNA。,联会复合体是减数分裂合线期两条同源染色体之间形成的一种结构，它与染色体的配对、交换和分离密切相关。,粗线期：-染色体变短，结合紧密，同源染色体等位基因之间部分DNA片段发生交换和重组（可见重组结）；-合成减数分裂专有组蛋白；-发生染色体外rDNA扩增。,重组结，中央成分，侧成分，同源染色体的染色单体,双线期：联会的同源染色体相互排斥、开始分离，但在交叉点(chiasma)上还保持着联系。植物细胞双线期一般较短，许多动物中双线期停留的时间长。人的卵母细胞在五个月胎儿中已达双线期，而一直到排卵都停在双线期。成熟的卵细胞直到受精后，才迅速完成两次分裂，形成单倍体的卵核。鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及无脊椎动物的昆虫中，双线期的二价体解螺旋而形成灯刷染色体，这一时期是卵黄积累的时期。,Visibleevidenceofcrossover,终变期：-二价体显著变短，并向核周边移动，在核内均匀散开。所以是观察染色体的良好时期。-交叉向端部移动，这种移动现象称为端化(terminalization)，端化过程一直进行到中期。-核仁此时开始消失，核被膜解体,中期,-核膜破裂纺锤体形成每个四分体含4个动粒,有丝分裂中期和减数分裂中期I,后期I-同源染色体对相互分离，并向两极随机移动；-细胞内染色体数目减半。,末期I，胞质分裂I和减数分裂间期,在减数分裂I和II之间的间期很短，不进行DNA的合成，有些生物没有间期，而由末期I直接转为前期II。,第二次减数分裂,可分为前、中、后、末四个四期，与有丝分裂相似。通过减数分裂一个精母细胞形成4个精子，而一个卵母细胞形成一个卵子及2-3个极体。,MeiosisII,脊椎动物配子发生过程,第二节细胞周期的调控(Cell-CycleControl),细胞周期调控系统的主要作用细胞周期检验点(CellCycleCheckpoint)MPFCyclin-Cdk复合物的多样性及细胞周期运转细胞周期运转的阻遏(细胞周期运转的负调控),LelandH.Hartwell,R.Timothy(Tim)Hunt,SirPaulM.Nurse,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人PaulNurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,细胞周期调控系统的主要作用,-在适当时候激活细胞周期各个时相的相关酶和蛋白-确保每一时相事件的全部完成-对外界环境因子起反应(如多细胞生物对增殖信号的反应),细胞周期检验点(checkpoint),细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制，主要是与外界环境因素整合，确保周期每一时相事件的有序、彻底完成。,G1期检验点：芽殖酵母Start；动物细胞RestrictionPoint,芽殖酵母中START调节点,哺乳动物细胞周期的控制,哺乳动物细胞周期的限制点（restrictionpoint）哺乳动物细胞体外培养时，需要添加多肽生长因子促进细胞的分裂；如果缺少生长因子,就会被阻止在G0阶段,一旦在培养基中添加了生长因子,这些细胞就能在1416小时后通过细胞周期限制点；细胞一旦通过了G1期的某一点（限制点）,这些细胞就能够进入S期并完成其后的细胞周期过程；-由此推测,哺乳动物细胞周期的限制点相当于酵母的START点。,细胞周期的控制系统,一、MPF的发现及其生化实质,细胞融合与PCC(Prematurechromosomalcondense)爪蟾卵子成熟过程MPF的发现MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶，由M期Cyclin-Cdk(Cyclin-dependentproteinkinase)形成的复合物，MPF=CDK1=p34cdc2+cyclinB。,1970年,Johnson和Rao将Hela细胞同步化在细胞周期中的不同时期，然后将M期细胞与其他间期细胞融合，发现与M期融合的间期细胞发生了形态各异的染色体凝集，称为染色体超前凝集(prematurechromosomecondensation)。,G1期细胞与M期细胞融合,人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：提示M期细胞存在诱导PCC的因子。,处于第六期的爪蟾卵母细胞（RD前期I），具GV,卵细胞提取物注射实验,注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，称做MPF(成熟促进因子)。,1988年，Maller实验室以非洲爪蟾卵为原料，分离获得了纯化的MPF，并证明其主要含有p32和p45两种蛋白，具有蛋白激酶活性。,MPF的结构组成,-是由两个不同的亚基组成的异质二聚体；-催化亚基是丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶其活性有赖于周期蛋白，故蛋白称为周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinases,Cdks);-调节亚基：周期蛋白(cyclin)。,MPF的结构,二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系,HartwellL等在不同温度下培养芽殖酵母,分离获得了数十个温度敏感突变体。所得到的酵母中与细胞分裂和细胞周期有关的基因称为cdc(celldivisioncycle)。,CellcycleofSaccharomycescerevisiae,PropertiesofS.cerevisiaecdc28mutants,芽殖酵母的Cdc28蛋白StudiesshowedthatS.cerevisiaecdc28andS.pombecdc2arefunctionallyhomologousgenes在G2/M期转换中起重要作用分子量也是34KD，称p34cdc28P34cdc28也是一种蛋白激酶-本身无激酶活性，必须与有关蛋白结合后才有激酶活性,芽殖酵母细胞周期中的Cdc28蛋白,GeneticstudiesofS.pombe(裂殖酵母),酵母的细胞周期基因突变-温度敏感突变型，可分成两类cdc突变这类突变在非允许的温度下培养，形成特别长的细胞;wee突变这种突变长得特别小而不能分裂。,120,ThefissionofS.pombe,cdc2突变的表型,裂殖酵母的MPF,-对突变体的研究发现，没有Cdc2的活性，细胞不能进入有丝分裂；序列分析表明该基因编码一个相对分子质量为34kDa的蛋白，该蛋白又称为p34cdc2蛋白；研究发现酵母Cdc2蛋白是一种蛋白激酶。,裂殖酵母的MPF活性调节,Cdc25蛋白激活裂殖酵母的MPF的活性Wee1蛋白抑制裂殖酵母的MPF活性Cdc2蛋白亚基上有两个磷酸化与去磷酸化位点。,Accumulationanddegradationofcyclinsinseaurchinembryos,MPF=CDC2+CyclinB,三、周期蛋白(cyclin)-在细胞周期中呈周期性变化；-含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框（cyclinbox），介导周期蛋白与CDK结合；-激活CDK，引导CDK作用于不同底物；-已知30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等；-cyclin在细胞周期的不同时期表达，从而激活不同时期的CDK激酶活性，表现为不同的调节功能。,cyclin在细胞周期的不同时期表达:G1期cyclin：cyclinD；G1/S期cyclin：cyclinE；S期cyclin：cyclinA；M期cyclin：cyclinB（也包括cyclinA）。M期cyclin在N端含有一段由9个aa残基组成的特殊序列，称为破坏框（destructionbox），和泛素介导的cyclinA、B的降解有关。G1期cyclin在C端有PEST序列。,周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶,(裂殖酵母),(芽殖酵母),(脊椎动物),四、CDK激酶与CDK激酶抑制物Cdc2(CDK1)与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)。CDK含有一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，即PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。,CDKI(CDK激酶抑制物)CDKinhibitor，CDKI或CKI，对细胞周期起负调控作用，分为两个大的家族：INK4(Inhibitorofcdk4):P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d。特异性抑制cdk4cyclinD1,cdk6cyclinD1。KIP(Kinaseinhibitionprotein)/CIP(cyclininhibitionprotein1):P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多数CDK的激酶活性。P21cip1主要对G1期CDK激酶复合物起抑制作用，还能与DNA聚合酶的辅助因子增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)结合，直接抑制DNA的合成。,P21cip1抑制CDK和PCNA,五、细胞周期运转调控,Cyclin-CDK是调控细胞周期的引擎：不同的周期蛋白与不同的CDK结合，构成不同的Cyclin-CDK；不同的Cyclin-CDK在不同的时相表现活性，影响不同的下游事件。,G2/M期转化与CDK1激酶的关键调控作用-G2/M期的转化和CDK1-cyclinB激酶密切相关-CDK1-cyclinB激酶，即MPF=p34cdc2（或p34cdc28）+clyclinB-cdc2蛋白在细胞周期中含量稳定，而CyclinB的含量呈周期性变化，故CDK1-cyclinB激酶活性呈周期性变化，在G2期晚期阶段达到最大值并持续到M期的中期阶段。,CDK1-CyclinB的激活wee1将cdc2的Thr14和Tyr15磷酸化，抑制其活性；CDK活化激酶（CDK1activatingkinase，CAK）将cdc2的Thr161磷酸化，这种磷酸化能最大激活其活性。但只要Tyr15处于磷酸化状态，其活性就被抑制。此时，这种没有活性的CDK1-CyclinB复合物即为pre-MPF。M期，磷酸酶Cdc25使cdc2的Thr14和Tyr15去磷酸化，复合物激活。这种机制保证了CDK-cyclin能够不断积累，然后在需要的时候突然释放。,CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化,Wee1,cdc25,CAK,MPF活性的正反馈调节,CDK1-cyclinB激酶使底物蛋白磷酸化，从而启动细胞从G2期进入M期的相关事件：如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩；核纤层蛋白磷酸化使核膜解体；p60c-src磷酸化，使细胞骨架重排（纺锤体装配）；核仁蛋白磷酸化，核仁解体。,2.M期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化-在中期当MPF活性达到最高时，激活后期促进因子（anaphasepromotingcomplex,APC），APC介导cyclinA、CyclinB通过“泛素化途径（ubiquitinationpathway）”选择性地被降解，CDK1活性丧失，在前期被CDK1磷酸化的蛋白质去磷酸化；-APC还介导后期抑制因子AnaphaseInhibitors（维持姐妹染色单体粘连，抑制后期启动）的降解，促使细胞周期由中期向后期转化。,有丝分裂的退出：周期蛋白B的降解,-细胞周期蛋白基因的cDNA分析-N端破坏框(destructionbox),泛素化修饰与周期蛋白的降解(polyubiquitination),ubiquitin-activatingenzyme,E1ubiquitin-conjugatingenzyme,E2ubiquitinligase,E3-蛋白酶体的降解作用-促后期复合物(anaphase-promotingcomplex,APC),Polyubiquitination,RegulationofmitoticcyclinBlevelsincyclingcells,纺锤体检验点（SpindleassemblyCheckpoint）的机制：动粒上装配有Cdc20和Mad2蛋白。Cdc20是APC的正调控因子；Mad2和Cdc20结合能抑制Cdc20的活性；当动粒微管没有捕获全部动粒时，就无法激活APC（中期不能向后期转化）；动粒全部被动粒微管捕获后，Mad2从动粒上消失，对Cdc20的抑制解除，促使APC活化降解M期cyclin。,3.G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。CylinE-CDK2激酶直接参与中心体复制的起始调控。,CyclinD与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F,G1Cyclin-Cdk复合物对Rb蛋白磷酸化而调控G1检验点,DNA复制仅一次DNA的复制是由起始复制点（originsofreplication）开始的。在整个细胞周期中，起始复制点上结合有起始识别复合体（Originrecognitioncomplex,ORC），其作用就象一个停泊点，供其它调节因子停靠。CDC6是其中的一个调节因子，在G1期CDC6含量瞬间提高，CDC6结合在ORC上，在ATP供能下，促进6个亚单位构成的MCM复合体和其他一些蛋白结合到ORC上，形成前复制复合体（pre-replicativecomplex，pre-RC），MCM实际上就是DNA解旋酶（helicase）。S-CDK触发pre-RC的启动，同时阻止了DNA再次进行复制。因为S-CDK将CDC6磷酸化，使其脱离ORC，磷酸化的CDC6随后被SCF参与的泛素化途径降解；S-CDK还可以将某些MCM磷酸化，使其被输出细胞核。其它一些CDK也参与阻止pre-RC的再次形成，从而保证了DNA的复制仅一次。,每个细胞周期启动一次DNA复制,SCF（skp1-cullin-F-boxprotein，三个蛋白构成的复合体）负责将Ub连接到G1/S期Cyclin（如Cyclin