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文档简介
1,遗传学实验,模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定,2,二、实验目的,提取植物基因组DNA的方法PCR操作方法琼脂糖凝胶分离核酸方法,3,三、实验原理,1.Ti质粒和T-DNA:,Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物细胞时,该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。,4,将Ti质粒进行改造,将感兴趣的基因放进T-DNA区段中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。,5,2.T-DNA插入基因内部导致基因突变T-DNA插入到植物染色体上的什么位置,是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部,特别是插入到外显子区,将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞,是获得植物突变体的一种重要方法。,6,3.用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体农杆菌Ti质粒转化植物细胞后,在获得的后代分离群体中,有T-DNA插入的纯合突变体,杂合突变体,和野生型。在突变体研究中,需要的材料是纯合突变体,所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。,7,利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物BP是T-DNA区段上的引物,8,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:,9,扩增结果,经过PCR,在野生型植株,LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物(大带);在杂和突变体,LP和RP能扩增出分子量较大的产物(大带),另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物(小带);在纯合突变体,只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物(小带)。,10,11,2*CTAB提取液(PH8.0)2%CTAB1.4MNaCl20MmEDTA(PH8.0)100MmTris-HCl(PH8.0)0.2%巯基乙醇CTAB提取液(1000ml)组成:20gCTAB100ml1MTris-HClpH8.040ml0.5MEDTApH8.081.8gNaCl0.2%(V/V)-巯基乙醇),12,步骤,1.用液氮将100mg幼嫩叶片研磨成细粉,置于1.5ml离心管中加入预热至65的600l的2CTAB提取液,轻摇混匀。2.65水浴30min,其间轻摇混匀。3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),室温下轻轻混匀10min,12000rpm离心15min,再转移上清入新管。4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇,小心混匀,-20下30min,12000rpm离心15min,弃上清。5.用70%乙醇洗涤沉淀一次,12000rpm稍离心,弃上清。6.将沉淀晾干,加20-50lTE(pH8.0),65水浴30min溶解DNA。7.琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量。,13,PCR原理和方法,聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;,14,PCR标准反应体系,DNA模板引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶,15,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度加量过多导致非特异性扩增增加特异性长度适当、避免二级结构和二聚体完整性避免反复冻融浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则,引物,扩增产物太少,16,引物设计软件,PRIMERPREMIER5Oligo6,17,反应体系对PCR扩增的影响,反应Buffer,pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂,Mg2浓度,过高非特异性严重过低无扩增产物,dNTPMixture,浓度适当避免反复冻融,ddH2O,pH值适当避免污染,18,如何选择最合适的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性,纯度,稳定性,酶活性,19,反应体系,H2O10 xTaqbuffer(MgCl2free)MgCl2(25mM)引物LP(10uM)引物RP(10uM)引物BP(10uM)dNTP(各2.5mM)模板DNA(30-50ng/l)Taq酶(5U/l),20,反应体系(三引物体系),25ul体系H2O15ul10 xTaqbuffer(MgCl2free)2.5ulMgCl2(25mM)2ul引物LP(10uM)1ul引物RP(10uM)1ul引物BP(10uM)1uldNTP(各2.5mM)0.5ul模板DNA(30-50ng/l)2ulTaq酶(5U/l)0.2ul,21,反应体系(双引物体系),25ul体系H2O16ul10 xTaqbuffer(MgCl2free)2.5ulMgCl2(25mM)2ul引物LP或(引物BP)(10uM)1ul引物RP(10uM)1uldNTP(各2.5mM)0.5ul模板DNA(30-50ng/l)2ulTaq酶(5U/l)0.2ul,22,反应程序,预变性945min9440sec5350sec7280sec循环35次7210min,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤变性退火延伸,23,LPTCATCCACCATGGAAGAAAAGRPTTGGATACGATGCGAGTAACC中间引物BPTGGTTCACGTAGTGGGCCATCG用LP+RP产生大带:1107bp用LBa1+RP产生小带:560-860bp,24,琼脂糖凝胶电泳技术,DNA含有PO43-基团,在pH8.0Buffer中带负电,在电场中向正极移动。自由电泳时,由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同,各核酸分子难以分开;,25,选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物,使之具备一定的孔径,即可发挥分子筛效应,使大小不同的核酸片段迁移率出现较大
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