课题2　月季的花药培养 (4)

课题2月季的花药培养,知识回顾,单倍体育种的过程？,花药离体培养（N）,单倍体植株（N）,秋水仙素处理，使染色体翻倍,植株（2N）,特点：1明显缩短育种年限,2后代植株都为纯合子。,正常植株（2N）,一、被子植物的花粉发育,花粉母细胞（小孢子母细胞）,4个小孢子,减数分裂,小孢子四分体,1个小孢子,花粉粒（双核）,有丝分裂,单核,双核,花粉管细胞核,1营养细胞,生殖细胞核,2个精子,花粉是单倍体的生殖细胞,取决：培养基中的激素种类及浓度配比,二、产生花粉植株的两条途径,不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感,接种的花药时期,花药早期的花药比后期的更容易产生花粉植株，一般在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，即单核靠边期，花药培养的成功率最高。,材料的选择（选材是否成功是花药成功培养的关键）,三、影响花药培养的因素,其它时期选择的缺点,选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药。,为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。选择完全未开放花蕾的原因：完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒。,单核期花药的挑选,完全未开放的月季花蕾,略微开放的月季花蕾,为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？,花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。一般月季的花药培养时间选在5月初到5月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功率。,花药培养的所采用的培养基可能因植物种类的不同而有所差异。亲本植株的生长条件和材料的低温处理以及接种密度也是重要的影响因素。月季花药培养的培养基一般为：MS培养基配方中添加：2,4D0.4mg；KT0.2mg；IAA4mg.,培养基的选择,（一）材料选取,2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。方法：醋酸洋红法(将染色体染成红色)焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)。,1、从花药看：月季的初花期从花粉看：单核期从花蕾看：完全未开放的,四、实验操作,（二）材料的消毒,5、无菌水冲洗35次花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态,1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒,2、无菌水清洗,3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分,4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中24分钟（质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）,在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药，立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10个。,要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。,1、接种要求,勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。,注意：,（三）接种和培养,培养条件：温度25左右，PH5.8。幼小植株形成后才需要光照。,3、培养,培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。,注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。,在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是营养细胞核和生殖细胞核融合造成的）。,4、鉴定和筛选,五、课题成果评价,选材是否恰当选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。,无菌技术是否过关如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题接种是否成功如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。,六、小结：月季的花药培养,1.花粉发育：小孢子四分体时期单核期双核期。2.两条途径：脱分化形成愈伤组织或胚状体。3.影响因素：材料的选择和培养基的组成。4.操作流程：选择单核期的花药消毒接种培养鉴定和筛选。,下图是月季花药离体培养产生花粉植株的两种途径，请据图回答有关问题：,1）选用的材料合适与否是成功诱导出花粉植株的重要因素，一般来说选用期的花粉可提高成功率。选择花粉时，一般要通过来确定花粉是否处于合适的发育期，这时需要对花粉的细胞核进行染色，常用的染色剂是。,单核,镜检（显微镜观察）,醋酸洋红,2）上图中花药经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取决于培养基中。3）胚状体与愈伤组织在结构上的主要区别在于愈伤组织的细胞排列疏松无规则，是一种高度的薄壁细胞，胚状体与发育形成的胚有类似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。4）无菌技术也