第四章 DNA疫苗ppt课件

第四章DNA疫苗,第一节概述,一、DNA疫苗的产生,Wolff等：小鼠基因治疗试验(1999)对照动物将带有报告基因的质粒DNA直接肌肉注射入意外发现：肌细胞内：检测到该外源基因的表达产物引起了广泛关注,报告基因(reportergene),一个其表达产物非常容易被鉴定的基因应用：与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。如：荧光蛋白、荧光素酶、半乳糖苷酶等,绿色荧光蛋白（GFP）,一、DNA疫苗的产生,1992年，Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA，导入小鼠的表皮细胞小鼠血中：检测到特异性抗生长激素抗体再次注入加强剂量质粒：免疫反应增强。,一、DNA疫苗的产生,Ulmer等（1993）将重组甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein，NP)的cDNA片断插入含有巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒中将该质粒直接注射入小鼠的四头肌内结果：小鼠产生了特异的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答和高滴度的抗体。,许多其他动物试验都观察到：外源基因表达后，被机体免疫系统识别并激发包括细胞免疫和体液免疫的免疫应答。提出：DNA疫苗为疫苗的研究，开辟了一条崭新的道路。,DNA疫苗,DNA疫苗,定义,DNA疫苗：指含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA，经直接接种体内后，可被体细胞摄取，并转录、翻译、表达出相应的抗原，然后通过不同途径刺激机体，产生针对此种抗原的免疫应答。,核酸疫苗(nucleicacidvaccine),新型疫苗（1990-）第三次疫苗革命”美国纽约科学院：疫苗学的新纪元（1995）又称为：基因疫苗(geneticvaccine)基因免疫(geneticimmunization)核酸免疫(nucleicacidimmunization),核酸疫苗,组成：能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因载体直接导人机体细胞后：不与宿主染色体整合通过宿主细胞的转录系统，表达蛋白抗原诱导宿主产生细胞免疫和体液免疫应答达到预防和治疗疾病的目的。,核酸疫苗,核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗目前研究得最多的是DNA疫苗核酸疫苗DNA疫苗。由于DNA疫苗不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗(nakedDNAvaccine)。,二、DNA疫苗的组成,编码目的抗原的基因质粒表达载体,编码目的抗原的基因（目的基因）,机体预防和阻止细菌、病毒、寄生虫等病原体感染的保护性抗原以及肿瘤等相关抗原蛋白的编码基因针对某一种抗原的单基因片段或基因的cDNA一组基因多个基因(多重抗原性基因)嵌合型基因关键：其表达抗原蛋白的免疫原性越强，诱发宿主产生的免疫应答也越强。,质粒表达载体,能够携带抗原基因转移进入细胞中，并高效表达的细菌质粒多个限制性内切酶位点选择性标记真核细胞的启动子SV40，Rous肉瘤病毒和巨细胞病毒等启动子。是DNA疫苗的主体，其表达抗原蛋白的能力越强，诱发宿主产生的免疫应答也越强。,三、DNA疫苗的特点,DNA疫苗既能诱导细胞免疫应答，也能刺激产生体液免疫反应原因：表达产物一部分在降解后与MHC-I类分子结合一部分也可分泌出去，经抗原递呈细胞(APC)等途径与MHC-II类分子结合。,DNA疫苗诱导细胞免疫应答,DNA疫苗诱导体液免疫应答,三、DNA疫苗的特点,DNA疫苗的使用较为安全可靠可根据需要设计、选择DNA疫苗的抗原基因，靶向性明确;质粒载体上的CpG基序具有强烈的佐剂作用，故DNA疫苗接种时一般不需外加佐剂。,三、DNA疫苗的特点,价格低廉，适合发展中国家研制、开发和使用。质粒经转化细菌扩增后，其提取、纯化等制备过程远比蛋白质纯化技术简单得多，省钱、省时和省力，适宜于规模性生产；DNA疫苗在常温下性能稳定，可以室温保存，不需要冷链运输，容易保证高效接种率。,三、DNA疫苗的特点,多途径免疫接种，易为免疫对象所接受，也有利于模拟自然感染途径。注射方式（皮内、皮下、肌内等），也可以用基因枪注射接种非注射方式：口服、鼻内滴注、鼻腔喷雾及阴道接种等,基因枪,利用高压气体加速，将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的植物组织或者细胞中这一加速设备称为基因枪,第二节DNA疫苗的构建及免疫,一、DNA疫苗的构建,1.目的抗原基因的选择及获得表达载体及其选择表达载体上编码基因的序列测定：测序仪,1.目的抗原基因的选择及获得,抗原基因内部是否有稀有密码子？抗原基因内部是否含有内含子？抗原基因在哺乳动物细胞内是否能得到正确剪切？目的：使抗原基因在哺乳动物细胞内获得高效和正确的表达,破伤风DNA疫苗,Stratford等(2000年),DNA疫苗中使用偏爱的密码子，能够提高蛋白的表达量，也因此增强了DNA疫苗的免疫原性。,1.目的抗原基因的选择及获得,(1)构建cDNA文库以筛选获得候选基因采用核苷酸探针进行筛选非表达型cDNA文库采用蛋白质的免疫原性进行筛选表达型cDNA文库,1.目的抗原基因的选择及获得,(2)PCR法扩增候选基因(3)人工合成候选基因-DNA自动合成仪适用于上述两种方法难以获得的候选基因需要对已有基因进行偏爱性密码子改造的抗原基因,2.表达载体的选择,哺乳动物细胞表达载体的必备元件：复制起始点，可在原核细胞中扩增至高拷贝;有效的启动子元件，达到高水平转录;mRNA加工信号，包括mRNA切割和聚腺苷化信号，以及间插序列(内含子);,2.表达载体及其选择,哺乳动物细胞表达载体的必备元件：含有多个限制性内切酶位点，以供外游、基因的插入;选择性标记，以供选择含有目的基因质粒的阳性克隆;质粒骨架序列，使其能够在细菌中增殖。,(1)启动子和增强子元件,病毒启动子/增强子元件存在于所有商品化的哺乳动物表达质粒SV40早期基因增强子Rous肉瘤病毒基因的长末端重复序列(LTR)人巨细胞病毒(hCMV)来源于哺乳动物细胞的启动子-更安全-肌动蛋白启动子肌酸激酶启动子肽链延长因子启动子热休克蛋白启动子等。,(2)终止信号和多聚腺苷酸化信号,终止信号：来源于病毒或细胞基因3的一段序列来源于SV40小t抗原基因、-球蛋白基因牛生长激素基因(如pcDNA3，VRI012)的转录终止片段。聚腺苷酸化信号：可以提高mRNA的稳定性及翻译的效率晚期SV40聚腺苷酸信号,(3)mRNA加工信号,在编码区的上游插入一个内含子序列可以促进基因的表达并提高表达产物对免疫应答的激发内含子在转录单位中的位置也是决定表达效率的因素。目前大部分DNA疫苗表达载体都使用了来自人巨细胞病毒（hCMV）的内含子。,(4)真核细胞选择性标记及原核细胞选择性标记,真核表达载体的选择性标记:显性选择性标记：对受体细胞无特殊要求，能够在任何哺乳动物细胞中使用;隐性选择性标记：对受体细胞有特殊要求，必须在缺乏相应酶活性的哺乳动物细胞中使用。,真核表达载体的选择性标记,氨基糖苷磷酸转移酶(APH)原理：细菌转座子Tn5和Tn601均能编码APH，APH对包括Geneticin(G4I8)、卡那霉素、新霉素在内的氨基糖苷类抗生素产生抗性。许多小鼠、大鼠、猴、人等在内的多种哺乳动物的细胞均对G4I8很敏感利用G4I8便能将转染了携带有相应选择标记表达载体的细胞筛选出来。,真核表达载体的选择性标记,潮霉素B磷酸转移酶显性选择性标记当具有该酶基因的表达载体导人哺乳动物细胞后，便可用潮霉素进行筛选。,真核表达载体的选择性标记,大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)作为显性选择性标记表达XGPRT的载体可以使被转染哺乳动物细胞在腺嘌呤，黄嘌呤和霉酚酸抑制剂存在的情况下也能生长。作为隐性选择性标记表达XGPRT的载体可以使哺乳动物次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)活性缺乏的细胞能够在HAT(含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷)培养基上生长。,真核表达载体的选择性标记,胸苷激酶(tk)隐性选择性标记tk-细胞突变株：不能在HAT培养基上生长被含有tk基因的质粒转染并且表达的细胞：能够在HAT培养基上生长。,真核表达载体的选择性标记,二氢叶酸还原酶(DHFR)阳性克隆缺失DHFR的CHO细胞突变株:不能在没有胸苷，甘氨酸和嘌呤的培养基上生长被携带有DHFR基因的质粒转染并表达的缺失DHFR的CHO细胞突变株:能在没有上述添加剂的培养基上生长。,原核选择性标记,药物抗性标记-常用氨苄青霉素卡那霉素等营养缺陷标记-不常用,(5)质粒的基本骨架单位,复制起始点：表达载体通常具有哺乳动物细胞及大肠杆菌的复制起始点，以便能在真核及原核细胞中复制达到较高的拷贝数。原核复制起始点：ColE1，具有该起点的质粒能够在大肠杆菌中保持20个以上的拷贝数真核复制起点：SV40(nkCMVintBL)和多瘤病毒(pcDNA1)在疫苗构建完成，上临床前最好将其剔除，以防止质粒在体内无限复制。,(5)质粒的基本骨架单位,多克隆位点：供外源基因的插入，含有多个限制性内切酶位点。,3.表达载体上编码基因的序列测定,需要验证:表达载体上的基因确为目的基因片段基因序列是否与预期的基因序列完全一致限制酶切鉴定基因测序,二、DNA疫苗的制备,在免疫接种前需要制备高纯度，构象较为单一的大量质粒DNA。对含有目的基因质粒的菌种进行多步扩增；获得大量带有目的基因质粒的菌体；目的基因质粒的提取、纯化和浓缩；进行动物试验和临床试验。,1.细菌的扩增,(1)固体培养基细菌培养主要用于转化细菌培养以及大量扩增前单菌落的挑选。(2)细菌的小量扩增-试管(3)细菌的大量扩增-三角瓶内(4)细菌的发酵培养-发酵罐中温度、溶氧、pH值、转速动态检测(OD600)测量碳源的含量,2.质粒的大量提取,细菌的裂解方法碱裂解法、溶菌酶法、煮沸裂解法、去污剂法、有机溶剂法、超声粉碎法和高压匀浆法等。这些方法各有利弊，一般要根据宿主菌的特性、质粒的性质以及后续的纯化方法等诸多因素加以综合考虑。,3.质粒DNA的纯化,DNA疫苗要求质粒具有较高的纯度，无蛋白质、染色体DNA以及RNA等杂质要求质粒DNA具有较为单一的分子构型，一般要求为共价闭合环状。(1)聚乙二醇沉淀法(2)柱层析纯化(3)氯化铯-溴化乙锭(EB)梯度平衡超速离心法质粒DNA提取试剂盒最常用,在制备得到高纯度的质粒DNA疫苗以后，需要验证表达质粒能在哺乳动物细胞内高效正确地表达目的蛋白！将其导入哺乳动物细胞内，检测目的蛋白的表达,三、体外哺乳动物细胞短暂转染试验,三、体外哺乳动物细胞短暂转染试验,1.外源DNA导入哺乳动物细胞的方法2.基因表达产物的检测,1.外源DNA导入哺乳动物细胞的方法,(1)磷酸钙转染法通过形成DNA-磷酸钙共沉淀物，并将其黏附到哺乳动物细胞表面，经过一段时间的共同培养后，DNA能够被细胞所捕获而进入细胞中。(2)电穿孔转染法哺乳动物细胞在高压电脉冲的作用下，细胞膜上会出现微小的空隙，处于细胞周围的外源DNA分子便会穿孔而入，被细胞所吸收。,1.外源DNA导入哺乳动物细胞的方法,(3)脂质体转染法包装有外源DNA的脂质体和细胞共同孵育一段时间后，能被细胞吸收。其感染性要比裸露的DNA高得多。(4)DEAE-葡聚糖转染法能够促进哺乳动物细胞捕获和吸收外源DNA用于基因的瞬时表达，不易形成稳定的细胞系DEAE-葡聚糖对细胞有一定的毒性，只适用于某些细胞系(如:COS，CV-1),2.基因表达产物的检测,(1)免疫荧光抗体法检测表达蛋白无需提取蛋白的操作，简单易行定性鉴定操作步骤:细胞爬片用丙酮或丙酮/甲醇(1/1，V/V)固定细胞与第一抗体(被检蛋白的单抗或多抗)作用与荧光标记第二抗体共同孵育荧光显微镜下观测和照相,2。基因表达产物的检测,(2)蛋白印迹法检测蛋白表达结合了凝胶电泳分辨率高和免疫测定的特异性和敏感性等优点。操作步骤:哺乳动物细胞蛋白的提取SDS-PAGE电泳将凝胶上的蛋白条带转移到固相支持物上(目前最为常用的为硝酸纤维素膜)封闭液封闭与第一抗体(被检蛋白的单抗或多抗)作用与酶标第二抗体作用显色液显色。,四、动物免疫试验,1。动物模型的选择动物模型：鱼、鸡、小鼠、大鼠、家兔、猫、狗、雪貂、牛、猪以及非人灵长类动物等。,四、动物免疫试验,动物模型的选择注意事项：动物性疾病防治的DNA疫苗，可以直接用相关动物进行试验鸡新城疫病毒的DNA疫苗鸡防治人类或较大动物疾病DNA疫苗，先使用较小动物开展最初的动物试验如：以小鼠为动物模型,四、动物免疫试验,动物模型的选择注意事项：选择对病原体较为敏感，能够产生相应病征指标甚至死亡的动物，从而能够更好地评价DNA疫苗的效果;在小动物上获得的试验结果，需要进一步扩展到较大动物。利用猴、黑猩猩等开展临床前试验,四、动物免疫试验,2.DNA疫苗的接种途径及其选择(1)肌内注射(2)皮内或皮下注射(3)鼻内滴注及鼻腔喷雾(4)其他免疫途径：口服、阴道接种、静脉注射及腹腔注射等,(1)肌内注射,横纹肌：最有效的摄取外源基因表达蛋白抗原的组织。优点：安全体积大免疫接种容量大,(1)肌内注射,缺点：质粒DNA载体进入肌组织后，在肌纤维外的间质内扩散，影响扩散的主要屏障是肌束膜灵长目动物肌组织中肌束膜较啮齿类动物的厚且致密因此，灵长目动物中肌注外源性DNA的表达率低于啮齿类动物。,(2)皮内或皮下注射,基因枪介导的皮内或皮下导入局部皮肤表面涂布DNA疫苗（先去除皮肤的角质层细胞）转染率：皮内或皮下免疫肌内注射但是，皮肤组织具有很多参与抗原递呈的细胞，通常只需要极少量的DNA疫苗即可诱发长时间的保护性免疫。,(3)鼻内滴注及鼻腔喷雾,Okada等(1997年)向小鼠鼻内滴注含编码HIV-1抗原的DNA载体小鼠体内诱导产生了高水平的体液免疫和细胞免疫反应排泄物及阴道分泌物：黏膜分泌型IgA提示：鼻内接种的方式能够诱导有效的中和抗体产生,(3)鼻内滴注及鼻腔喷雾,组织定位和表达动力学（2001年）接种后2-4w:荧光原位杂交肺、肝、肾、脾、局部淋巴结、胚胎和食道：质粒肺、肝和脾：特异的mRNA肺部：特异蛋白鼻内接种能够诱导较强的免疫反应,四、动物免疫试验,3.DNA疫苗的接种方案多次免疫接种由于多数DNA疫苗在体内表达量低，持续时间长，因而DNA疫苗在动物和临床试验中往往需要多次免疫接种。实验证明：多次加强免疫在小动物试验中能够增强免疫反应，获得较为理想的免疫效果。,四、动物免疫试验,3.DNA疫苗的接种方案与其他类型疫苗匹配进行免疫方法1：初次免疫:DNA疫苗进行肌内接种加强免疫：重组痘苗病毒疫苗方法2:基础免疫：DNA疫苗，刺激机体的细胞免疫系统加强免疫：基因重组蛋白，刺激产生抗体,显著提高特异的CTL反应，并能增强清除感染和抗攻击能力,五、DNA疫苗的免疫学效果评价,体液免疫反应;细胞免疫反应;免疫保护率。,五、DNA疫苗的免疫学效果评价,1。体液免疫反应效果评价阳转率抗体滴度黏膜分泌型IgA抗体滴度B细胞功能B细胞增殖试验;抗体生成细胞数测定。间接反映体液免疫应答的细胞因子水平IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等参与B细胞介导免疫应答的细胞因子的含量。,五、DNA疫苗的免疫学效果评价,2.细胞免疫反应效果评价T细胞功能测定NK细胞活性测定间接反映细胞免疫应答状况的细胞因子检测,T细胞功能测定,T细胞增殖反应试验3H-TdR搀入法MTT法细胞毒T细胞的功能测定51Cr释放法3H-TdR释放法乳酸脱氢酶(LDH)释放试验,NK细胞活性测定,形态观察法核素释放法LDH释放法,间接反映细胞免疫应答状况的细胞因子检测,细胞因子检测的主要指标:IFN-和IL-2的含量测定。,五、DNA疫苗的免疫学效果评价,3。保护率的测定反映机体免疫应答的综合指标，也是体液免疫应答与细胞免疫应答协同作用的结果。基本步骤:接种疫苗;病原体攻击;免疫保护率测定(相对保护率和绝对保护率)。,第三节DNA疫苗的发展及现状,一、DNA疫苗国内外研究现状,（1）多基因表达载体单基因疫苗的不足：单基因疫苗难以奏效，难以产生有效抗体的病原体变异较快的病原体（如HIV）目的：同时诱导机体产生针对不同抗原的免疫应答,取得了较好的效果,一、DNA疫苗国内外研究现状,（2）基因疫苗的免疫佐剂研究细胞因子，能够增强基因疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等（3）新的免疫途径直接注射到局部淋巴结或脾脏等。,二、DNA疫苗的应用,1.病毒性疾病人免疫缺陷病毒DNA疫苗乙型肝炎病毒DNA疫苗流感病毒DNA疫苗2.细菌性疾病结核分支杆菌DNA疫苗破伤风杆菌,3.寄生虫病疟原虫症疾利什曼原虫4肿瘤根据胚胎抗原构建的DNA疫苗根据病毒相关抗原构建的DNA疫苗其他肿瘤相关抗原构建的DNA疫苗。,第四节DNA疫苗的免疫学原理,第五节DNA疫苗的安全性,一、DNA疫苗的安全性评价,临床前研究：将体内与体外的所有实验数据汇总后，来评价该疫苗进入I期临床是否足够安全。疫苗所诱导产生的免疫类型持续时间、免疫途径免疫次数动物试验：必须符合GLP动物模型要有针对性，应包括老年动物以评价其在老年人中的应用效果。,一、DNA疫苗的安全性评价,1.局部反应和系统毒性研究2.遗传毒性研究3.生殖毒性研究4.肿瘤发生相关性研究5.疫苗佐剂和接种设备的安全性评价,1.局部反应和系统毒性研究,系统毒性研究潜在的靶器官毒性(包括造血系统及免疫系统)病理和组织病理以及总的评价局部反应研究来源于注射部位组织活检或尸检报告的详细资料。其他：疫苗接种后在组织中特异性的分布情况疫苗在宿主细胞存在及表达的持续时间及强度DNA疫苗是否具有免疫毒素作用(是否产生免疫耐受或者介导自身免疫)DNA疫苗中含有的细菌蛋白污染物能否诱导产生相应的免疫反应。,2.遗传毒性研究,如果质粒DNA内源性的宿主DNA发生重组：质粒DNA整合到基因组上，将有可能活化癌基因，同时抑制抑癌基因，从而导致插入突变;质粒DNA的插入还会导致染色体不稳定，发生断裂和重组。,2.遗传毒性研究,研究内容：使用PCR法来检测其组织分布性PCR法检测组织DNA样本中质粒DNA是否与基因组DNA发生了整合。,2.遗传毒性研究,具体的操作过程:在DNA疫苗中引入稀有的酶切位点免疫动物提取局部组织细胞的DNA利用上述稀有内切酶进行酶切，通过凝胶电泳将未整合到基因组的质粒与基因组DNA分开，回收基因组DNAPCR法检测基因组DNA中是否含有质粒DNA的片段。,3.生殖毒性研究,质粒DNA疫苗有可能迁移到性腺组织，进一步可能使生殖细胞发生变异。PCR法检测：来源于免疫后的雌性及雄性动物性腺的DNA样本。,4.肿瘤发生相关性研究,如果临床前研究结果：DNA疫苗具有整合活性和广泛的组织分布出现了危险的慢性表现要对疫苗的