PCR-STR亲子鉴定1ppt课件.ppt

PCR-STR法亲子鉴定,1,一、亲子鉴定定义二、原始的亲子鉴定方法三、现代的亲子鉴定方法,2,一、亲子鉴定的定义,亲子鉴定就是利用医学、生物学和遗传学的理论和技术，子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系。,3,二、原始的亲子鉴定方法,（1）外貌对比由于遗传的原因，父子、母子、兄弟姐妹之间的长相、肤色等一般都会有某些相似的地方，通过外貌长相的对比来确定亲子关系恐怕是最原始的方法，但这样方法只是一种猜测、判断，作为一种参考，不具有权威性。,4,5,演员姚晨相声演员李菁,6,我国演员林永健加拿大韩裔演员吴珊卓,7,（2）滴骨验亲滴骨验亲法就是将生者的血液滴在死人的骨骸上，若血液能渗透入骨则断定生者与死者有血源关系，否则就没有。三国时期的吴国人谢承所撰的会稽先贤传就记载有以弟血滴兄骨骸之上认领长兄尸骨的事例；（南史豫章王综传也记载有以子之血滴于父骨之上验亲的事例；至宋代，著名法医学家宋慈将滴骨验亲法收入洗冤集录中。据从现代的观点来看，这种方法并不科学，但开创了用血型鉴别血源关系的先河。,8,（3）滴血验亲滴血验亲法又称合血验亲法，就是将小孩的血与大人的血液放在一起，如果能融在一起，就是父母亲生的，否则就不是亲生的。,这种认样方法曾在中国宋代的法医著作里里记载过。这种方法没有科学依据，亲子关系的血液不一定能融合，而非亲子关系的血倒有可能融合,9,三、现代的亲子鉴定方法,（1）血型测试血型测试进行亲子鉴定就是通过对血型的检验比对来确定亲子关系。依据孟德尔遗传定律，人类的血型是按照遗传基因传给下一代，故一定血型的父母所生子女也具有相应的血型。用于血型检验来鉴别亲子关系的血型系统有：ABO、MN、Rh、Ss、hp等21个血型系统。检验的血型系统越多，其准确性就越高，如果血型检验的结果表示无遗传关系，可作出否定亲子关系的结论，但结果存在遗传关系，也不能完全确定是亲子关系,10,11,返回,12,（2）染色体多态性鉴定,染色体多态性，又称异态性，是指正常人群中常见的各种染色体形态的微小变异（如：随体增大、重复或缺失，着丝粒区的荧光强度变异等）。这种多态是可以遗传的。这项技术就是利用其形态来鉴定亲子关系，这要靠技术人员的主观判断，其准确率也不尽如人意。,13,（3）DNA鉴定,鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分型鉴定,包括:序列多态性和长度多态性。如:人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定，十分方便。常用方法有DNA指纹法、SNP-PCR法、PCR-STR法等。,14,1.DNA指纹法DNA指纹法的技术原理，又称RFLPDNA指纹分析技术，将生物检材中细胞核的DNA分离出来，用特定的限制性内切酶消化，后经电泳分离，Southern印迹转移，再用已知序列小卫星DNA探针根据碱基互补原则进行杂交，用放射自显影等技术显示出一系列不等距离，相互间隔的多条电泳谱带组成的高度多态性图谱，实质为DNA的限制性片段长度多态性（RFLP）图像，因各人不同（同卵双生除外），比对结果类似指纹。,15,优点：此技术可检测位点多、特异性高、稳定性强，已广泛应用于亲子鉴定、犯人确认、家族谱系研究，而且还扩大应用于疾病诊断、肿瘤以及动物遗传的研究中。缺点：DNA指纹法操作过程繁杂、周期长、实验条件高，而且不能确定每条带的染色体定位及各位点之间的独立性、在分型标准化方面也有困难。,16,2.PCR-SNP,指在两条同源染色体上，同源DNA序列长度相等，但个别核苷酸不同而产生的个体差异，也称单核苷酸多态性（SNP）。人类基因组中存在着广泛的多态性，最简单的多态形式是发生在基因组中的单个核苷酸的替代，即单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）。SNP通常是一种二等位基因的，即二态的遗传变异SNP的数量大、分布广，在组成人类基因组的30亿个碱基中，平均每1000个就有一个SNP。SNP作为第三代遗传标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学的研究中发挥着愈来愈重要的作用。,17,3.PCR-STR法,后来又发展出一些应用PCR的DNA分析技术的亲子鉴定方法，近年来常用的是下面介绍的PCR-STR法。,18,PCR-STR法亲子鉴定,1、PCR-STR简介和起源2、PCR-STR法的原理与理论基础3、PCR-STR法方法步骤4、PCR-STR法结果分析5、PCR-STR技术的优点6、PCR-STR法应用实例7、PCR-STR法应用前景,19,1.PCR-STR简介和起源,（）STRSTR是短串联重复序列（shorttandemrepeat）的简称,又称简单重复序列SSR，或微卫星DNA(micro-satellite)。STR是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，它由2-6bp的核心序列组成，通常重复15-60次，片段大小一般为100-300bp。STR主要由于核心序列的重复次数不同而具有高度多态性，是个体的特征，遵循孟德尔共显性遗传规律传递,绝大多数不受选择压力的影响，且较均匀地分布人类全基因组。,20,（）STR的产生机制,微卫星DNA重复顺序的产生则普遍认为是DNA复制过程中滑动，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失。微卫星DNA自发突变率仅104105，且核心序列越小，突变率越低。,（）STR多态性,因为STR具有高度的多态性，所以能广泛应用于法医学实践。STR的多态性一般是指由于核心序列重复次数不同而构成的长度多态性，而长度多态性检测已被广泛应用于法医学个人识别和亲权鉴定。,21,22,TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACAGGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC,靶区域(shorttandemrepeat),7repeats,8repeats,9repeats,10repeats,11repeats,12repeats,13repeats,核心串联重复次数存在个体差异性,23,（4）理想的STR基因座,从实用价值考虑，用于法医DNA分型的理想STR基因座应具备以下特点：等位基因片段长度在95bp-5OObp范围，最好在400bp以下；具有较高的杂合度及个人识别能力，一般杂合度在0.70以上，DP0.90；具有规律的四核苷酸或五核苷酸重复序列，阴影带出现率较低，较少或没有插入等位基因；等位基因数为1012个，等位基因易于区分；突变率低，不超过0.2；具有高度种属特异性。,24,PCR-STR起源,进入20世纪90年代，Mullis和Saiki等学者发明并改进的PCR技术被用于法医DNA分析，从而建立了以PCR为基础的第二代DNA分型技术。利用STR-PCR分型技术，可将人类遗传信息数字化，根据孟德尔遗传定律，子女的遗传信息来源其生物学意义上的父亲、母亲。通过人类遗传基因分析和现代化DNA检测技术可以确定父母和子女是否具有血缘关系。在亲子关系的鉴定上，亲子关系的概率可达到99.99%以上水平。,25,2.PCR-STR法的理论基础与原理,理论基础人类基因组是一个结构十分稳定的体系，同时又是一个变异的体系。在长期的进化过程中，基因组DNA的序列不断发生变异。这些变异有些被保存下来，导致了不同种族、群体和个体间基因组的差异和多态性。除同卵双生子外，没有两个个体基因组是完全相同的。尽管遗传多态性的存在，但每一个人的染色体必然也只能来自其父母，这就是DNA亲子鉴定的理论基础亲子鉴定是根据人类遗传学的理论和实践，从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，对可疑的父与子或母与子之间的亲生关系进行判断，并作出肯定或否定的结论。,26,原理不同个体中，STR核心序列的重复次数不同。根据子代的两条DNA一条来自于父方一条来自于母方，其子代某一特定DNA分子上STR核心序列重复次数必定与父母相同。根据微卫星DNA两端序列的保守性，设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。,27,28,以上述原则为依据，美国联邦调查局(FBI)推荐用于建设国家DNA数据库(combinedDNAindexsystem，C0DIS)的13个STR基因座，作为PCRSTR的常用检测基因座，也成为目前法医STR分型的基础位点。即D3S1358、THO1、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、VWA、D8S1179、TPOX、FGA.,29,5.PCR-STR法方法步骤,样本的选择DNA检测样本很多。一般来说，人体的任何组织或分泌物都可以做。,DNA样品收集主要采用抽少量静脉血或者末梢血或者收集口腔上皮细胞。此外，我们也可以进行头发、组织、血迹、胎儿的绒毛等特殊样本的DNA鉴定。,30,方法一：DNA测序法步骤：,材料处理破碎细胞壁以释放细胞内容物破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中DNA释放后，尽量确保DNA的完整性分离纯化（去除杂质包括大量的RNA、蛋白质、多糖、单宁和色素等）SSR（SimpleSequenceRepeat）引物设计根据CMD(CottonMarkerDatabase)已公布的序列来设计相对SSR引物。,31,PCR扩增琼脂糖凝胶电泳挖胶回收试剂盒、回收DNA片段与特定质粒形成重组DNA分子导入大肠杆菌，筛选白斑提取质粒DNADNA测序、比对,PRC扩增,32,比对示意图,33,DNA的提取,CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖留在溶液中。在高离子浓度下，CTAB与蛋白质和除大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。在一定的盐浓度下，DNA、蛋白质与多糖在CTAB溶液中溶解度不一样而达到去多糖的目的。生物体内的DNA与蛋白质结合在一起，提取时需除去其结合的蛋白质，然后再将DNA与RNA分开，并进一步纯化。此外需抑制DNAase的活性以防DNA被降解。基本环节：,34,方法二：Southern杂交法,步骤：样本的选择DNA的提取PCR扩增琼脂糖凝胶电泳转膜进行Southern杂交（探针设计）洗膜晾干包（用保鲜膜）压X光片（-20度-70度保存3到7天）冲洗观察杂交图谱（全自动条带分析系统）注：探针设计将微卫星DNA核心序列（CA)n串联起来，PCR扩增（加入P32标记的dNTP)电泳挖胶回收试剂盒回收DNA片段导入载体形成重组DNA分子导入大肠杆菌选择白斑一部分培养保存，一部分提取质粒DNA测序作为探针,35,36,6.PCR-STR法结果分析,电泳分离片段后，通过放射自显影技术检测单链DNA片段的放射性带，就可以直接读出DNA的核苷酸序列。如果小孩的遗传位点和被测试男子的位点超过3个不一致，那么该男子便100被排除血缘关系之外，即他绝对不可能是孩子的父亲。如果孩子与其父母亲的位点都吻合，我们就能得出亲权关系大于9999的可能性，即证明他们之间的血缘亲子关系。若有12个位点不同，要考虑是否发生了基因突变，这是要对多个STR序列位点进行鉴定。,37,7.STR-PCR技术的优点,传统的血清方法能检测红细胞血型、白细胞血型、血清型和红细胞酶型等，这些遗传学标志为蛋白质（包括糖蛋白）或多肽，容易失活而导致检材得不到理想的检验结果。此外，这些遗传标志均为基因编码的产物，多态信息含量（PIC）有限，不能反映DNA编码区的多态性，且这些遗传标志存在生理性、病理性变异（如A型、O型血的人受大肠杆菌感染后，B抗原可能呈阳性。因此，其应用价值有限。DNA检验可弥补血清学方法的不足，故受到了法医物证学工作者的高度关注。,38,PCR-STR技术有如下优点：1、模板DNA片段短，扩增效率高，灵敏度高；2、检材量少，仅需15ng的模板DNA；3、可使用快速的制备模板DNA；4、扩增结果易于分析，不需要放射性标记；5、可检测部分降解或陈旧性的生物材料，尤其适于检测血痕、精液斑、唾液、毛发、指甲、骨骼等；6、个人识别机率和非父的排除率高。,39,8.PCR-STR法应用实例,20世纪90年代，DNA分析技术开始应用于人类的亲缘关系研究。随着DNA序列分析技术的日趋成熟和广泛应用。利用PCR-STR进行序列分析也逐渐应用到家畜及野生动物的亲缘关系分析及个体识别上。,40,国际上关于亲子鉴定和DNA身份识别的两个最著名实例均与美国前总统克林顿有关A当矢口否认有任何不轨行为的总统被要求抽取血样以核对莱温斯基裙子上的污渍来源时，他只得承认错误以避免陷入更尴尬的境地；B后来黑人妇女威廉斯声称其13岁独生子丹尼的父亲是克林顿时，克林顿毫不犹豫地抽血化验，最后经DNA检测证明威廉斯所生的黑白混血儿并非克林顿的私生子，由此足见这一技术的可靠,41,二、海沧野生动物园为小斑驴采血做亲子鉴定,42,二、海沧野生动物园为小斑驴采血做亲子鉴定,7月3日，斑马和驴的爱情结晶国内首只斑驴诞生海沧野生动物园。先不说各地媒体和游客的热情围观，就是园里饲养员都表示：傻眼啦！原来，该园的一匹斑马和三头驴都散养在草食区里，它们怎么好上的，无人知晓。直到宝宝降生，这“旷世恋情”才得以曝光。不过，“男主角”是哪位，至今是谜。厦大的科研人员为三头公驴和小斑驴分别采集了400微升的血，进行亲子鉴定。,43,三、核桃亲子鉴定方法的建立,目的】针对核桃育种中父本不清、亲本混淆问题,建立简便快捷高效的核桃亲本鉴定方法,也为其它林木和