non coding RNA——现代分子生物学课程 ppt课件

,NoncodingRNA,海南大学园艺园林学院,RNA的研究进展,RNA组学：通过对RNA的研究所取得的巨大成果而形成了RNA组。RNA研究已有百余年的历史，其间有两个阶段时期。第一个阶段：20世纪的5060年代，各种RNA开始被发现，但对RNA的认识还不深入。第二个阶段：20世纪的80年代，RNA的功能逐渐被发现，越来越多的研究表明RNA在遗传方面的重要作用。,Non-codingRNA（非编码RNA）,非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能了。,分类,非编码RNA从长度上来划分可以分为3类：小于50nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50nt到500nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等等；大于500nt，包括长的mRNA-like的非编码RNA，长的不带polyA尾巴的非编码RNA等等。,根据亚细胞定位可将非编码RNA分为：细胞核非编码RNA与细胞质非编码RNA。根据是否具有polyA尾结构可将非编码RNA分为具有polyA尾的非编码RNA(polyA-plusncRNAs)和不具有polyA尾的非编码RNA(polyA-minusncRNAs。根据转录本的长度可将非编码RNA分为小非编码RNA和长链非编码RNA。,分类,根据生物学功能可将非编码RNA分为：持家非编码RNA和调控性非编码RNA。持家非编码RNA主要包括核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、引导RNA(gRNA)和端粒酶RNA;调控性非编码RNA主要包括小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、与Piwi蛋白相互作用的piRNA和长链非编码RNA(lncRNAs)。,分类,调控非编码RNA：长链非编码RNA（lncRNA）短链非编码RNA（siRNA、miRNA、piRNA）,非编码RNA,看家非编码RNA,调控非编码RNA,长链非编码RNA（lncRNA）长链非编码RNA通常是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本。该概念是在2002年由日本科学家首次提出,他们在小鼠全长cDNA文库的大规模测序中,鉴定了大量较长的非编码RNA转录本。短链非编码RNA（siRNA、miRNA、piRNA）它们的转录本序列都比较短，不超过40nt短链非编码RNA分子虽小，却参与了包括细胞增殖、分化、凋亡、细胞代谢以及机体免疫在内的几乎所有生命活动的调节和控制，在生命体内扮演着至关重要的角色。,长链非编码RNA（lncRNA）,lncRNA不参与或很少参与蛋白编码功能,位于细胞核内或胞浆内。近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、染色体修饰和基因组修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程，其调控作用正在被越来越多的人研究。,1.编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；2.抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；3.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5.与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；6.作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7.结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；8.作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。,RNA(smallnoncodingRNA),miRNA(microRNA)siRNA(smallinterferingRNA)piRNA(piwi-interactingRNA)esiRNA(endogenoussiRNA),siRNA,siRNA:是一类外源性的双链小分子RNA，它的长度一般为2125nt。它在RNA干扰途径中通过引导目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表达。siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲除（knockdown）效果，这使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。,miRNA,概念：miRNA是长约2125nt的单链RNA,其中50%定位于易发生结构改变的染色体区域。特点：miRNA是内源性的,是生物体基因的表达产物;miRNA是由不完整的发卡状双链RNA,经Drosha和Dicer酶加工而成。,piRNA,piRNA是近年来在哺乳动物细胞内发现的长度约为2431nt的RNA分子,因在生理状态下能与piwi蛋白偶联,故命名piRNA。由于Piwi为一表观遗传学调控因子,能与PcG蛋白共同结合于基因组PcG应答元件上,协助PcG沉默同源异型基因,因此推测与Piwi相关的piRNA也应具有表观遗传学的调控作用,piRNA的形成及扩增,piRNA前体与piwi蛋白结合后，能在u位点进行切割形成piRNA反义链，piRNA反义链能与转座子识别，并使切割后的转座子与AGO3蛋白结合，从而进一步对转座子进行修饰切割，切割后的转座子可以与piRNA前体结合，并且在U位点切割前体，从而使切割后的前体与piwi蛋白结合，进过剪切修饰形成PiRNA和PiRNA与Piwi蛋白结合的复合体，从而使PiRNA数量增多。,非编码RNA的比较,非编码RNA的作用,1.影响染色体的结构2.调控转录3.参与RNA的加工、修饰4.参与mRNA的稳定和翻译调控过程5.影响蛋白质的稳定和转运6.在植物适应环境胁迫中的调控作用7.在细胞发育和分化中的调控作用,非编码RNA的检测技术,cDNA克隆策略实时荧光定量（RT-PCR技术）SAGE技术微阵列芯片检测技术Solexa测序法表面增强拉曼光谱法,cDNA克隆策略,长度在20500bp的RNA大多为非编码RNA。非编码RNA可将由变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离到的非编码RNA进行逆转录后加上接头，并克隆到标准载体中构建cDNA文库。为防止5端丢失常在3端加上C-尾巴，在T4RNA连接酶的作用下连上寡聚核苷酸接头，最后对连接产物进行RT-PCR扩增。cDNA克隆策略可鉴别已知的高丰度非编码RNA，如tRNAs或小核糖体RNA。,实时荧光定量（RT-PCR技术）,实时荧光定量PCR技术是一种高通量、灵敏的基因表达检测技术，常用于蛋白编码基因表达检测，也被广泛地应用于microRNA或其他非编码RNA的表达检测。通过该技术，可定量监测目的基因的表达情况，筛选生物学功能相关的非编码RNA。,SAGE技术,SAGE是一种高通量的研究技术，通过逆转录得到cDNA,从而获得SAGE双标签,然后,通过连接、扩增双标签片段并进行克隆、测序，以同一标签在某组织中出现的频率，反映该标签所代表的基因在该组织中的表达丰度。与微阵列芯片技术相比，SAGE可在未知任何基因或EST序列的情况下，对靶细胞进行研究，具有显著的优越性。,微阵列芯片检测技术,微阵列芯片以高密度阵列为特征，在微阵列上固定大量探针分子，并将标记样本与微阵列探针进行杂交。通过检测杂交信号的强度，研究不同样本中特异基因的表达丰度，从而较为全面地比较不同样本中基因表达水平的差异。被广泛用于mRNA的研究，也被用于非编码RNA的发现与表达分析。,Solexa测序法,Solexa测序法是新发明并迅速得到广泛应用的一种高通量基因表达检测技术，该方法是利用单分子阵列来测定基因的表达情况。首先，将核酸从细胞中提取，将其片段化为100200碱基大小，分别连上接头，经接头引物的PCR扩增后制成文库；然后，将已加入接头的核酸片段固定在含有接头的芯片上，经反应后，将不同片段扩增。在每个循环中，利用边合成边测序的原理，在单分子阵列中加入4种荧光标记染料的核苷和聚合酶，在酶的作用下，每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，通过CCD采集荧光信号，快速扫描整个阵列，检测特定的结合在每个片段上的碱基，从而进行基因转录本的测序。,尽管Solexa测序技术以高效率、高精确鉴定miRNA著称，但相对于传统、普遍使用的miRNA定量方法还存在一定的不足，这可能是由于测序深度不足，或一些microRNA存在特殊修饰而带来的问题。,表面增强拉曼光谱法（SERS）,利用水的拉曼散射很微弱这一特点，高灵敏度和特异性的SERS检测技术逐渐成为研究水相中的生物和化学样品的理想工具，应用于病毒、细菌、蛋白和核酸等生物样品的检测。,克隆非编码RNA的方法,基因克隆法蛋白质-RNA复合物分离法,基因克隆法,小鼠脑组织匀浆提取总RNA8%PAGE回收50-110nt（fractional）和110-500nt（fractional）Poly(A)聚合酶加尾cDNApSPORTIPCR高密度陈列杂交除去高丰度已知的小RNA未杂交的cDNA测序。,蛋白质-RNA复合物分离法,分离蛋白质-RNA复合物，除去蛋白质，纯化RNA分子，反转录cDNA，克隆、测序、结果分析。所得RNA的cDNA分子必须进行Northern杂交，除去断裂的小RNA。,microRNA,2001年命名为microRNA,2002年入选为science年度十大发现之首,MicroRNA,microRNA（简称miRNA）是一种非编码小RNA分子（约含22个核苷酸，1925）存在于植物，动物和一些病毒中，其功能在RNA沉默和基因表达的转录后调控。,miRNA的特点,单链RNA1925nt，非编码RNA单一的目标miRNA可能靶向数百个基因抑制翻译（动物）或降解靶RNA（植物）对细胞的增殖、分化、凋亡、癌变及病毒感染起调控作用保守性进化,3.miRNA的鉴定方法和标准,2.miRNA的作用机理,1.miRNA的产生和特点,3.miRNA的鉴定方法和标准,2.miRNA的作用机理,1.miRNA的产生和特点,第一节,miRNA的产生和特点,miRNA的产生：植物miRNA的形成包括miRNA基因转录、加工成熟和功能复合体组配三个过程。miRNA基因转录：通过RNA聚合酶转录在细胞核中形成初级转录本，称为primarymiRNAs（pri-miRNAs）。植物的pri-miRNA通常由腺苷酸开头，具有5帽子和3-polyA尾，位于一个保守的TATA-box序列的下游40个核苷酸序列处。,第一节,miRNA的产生和特点,加工成熟：植物miRNA的加工成熟过程是由存在细胞核内的Dicer酶类似物，在HYL1蛋白的协助下，以一种ATP依赖的方式，通过两次剪切步骤生成。第一次剪切pri-miRNA后，产生具有茎环二级结构的pre-miRNA，接着在两个蛋白酶HYL1和SERRATE的协助下再次切割pre-miRNA，将miRNA/miRNA*二聚体从pre-miRNA茎环结构的“茎”上剪切下来。miRNA基因在细胞核中经由RNA聚合酶II进行转录、DCL1剪切后和HEN1介导的甲基化后，由转运蛋白家族中的核质转运蛋白HASTY（HST）从细胞核转运到细胞质中。,第一节,miRNA的产生和特点,功能复合体组配：miRNA/miRNA*二聚体中miRNA链在SDN的诱导下装载进入RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），成熟miRNA与ARGONAUTE1（AGO1）蛋白结合，形成非对称的RISC，而miRNA*则被降解。miRNA引导RISC切割目标靶基因mRNA，在转录后水平发挥生物学功能。,micorRNA的产生,micorRNA的产生,micorRNA的产生,micorRNA的产生,RISC：RNA-InducedSilencingComplex,一种多结构域的双链RNA专一性RNase,miRNA如何行使功能？,与mRNA的3端非编码区特定位点(其第28个核苷酸)绑定：与mRNA完美互补时会引发mRNA降解；不完美的与mRNA配对时，会引发转录后的基因沉默（抑制靶基因的表达）从而抑制或阻止相应的mRNA翻译过程。举例分析：在DNA修复通路中行使上述过程1）抑制或阻止正常细胞DNA修复产生致癌作用2）抑制或阻止癌细胞DNA修复达到治疗效果,植物miRNA的特点,植物miRNA与动物miRNA的相类似特点(1)miRNA广泛存在于真核生物中。(2)miRNA的长度约为2024nt。(3)miRNA没有开放阅读框(ORF)及蛋白质编码基因特点。(4)miRNA的基因成簇性。(5)miRNA的保守性。,植物miRNA的特点,植物miRNA与动物miRNA的相类似特点(6)miRNA表达的时空特异性。(7)几乎所有的miRNA从前体的1条臂中加工而来。(8)miRNA的5端多以U开头。,植物miRNA的特点,植物miRNA与动物miRNA的不同特点(1)植物miRNA前体的大小变化较大，一般为64303nt，而动物miRNA前体的变化较小，一般为6075nt。(2)植物中的miRNA较动物中的更为保守，它们与互补序列的错配数也少于动物。,植物miRNA的形成,miRNA成熟所需的酶类一种多结构域的双链RNA专一性RNase1II(Dicer酶、类Dicer酶)和Argonaute蛋白。Dicer酶包含4种结构域：RNA解旋酶结构域、PAZ(PiwiArgonauteZwille)结构域、2个RNase结构域和dsRNA结合结构域(dsRBD)Argonaute蛋白具有PAZ和PIWI结构域。,植物miRNA的作用机制,miRNA的作用方式可根据其与靶基因的互补程度不同而分为两种：转录产物裂解和翻译抑制。a.当miRNA与靶mRNA完全互补或接近完全互补时，则会切割mRNA；b.当植物miRNA与靶mRNA不完全互补时，则抑制其翻译。近年来研究发现，miRNA也可以通过目标染色体位点的甲基化，或通过调控靶mRNA的定位或稳定性在转录水平上发挥作用。,植物miRNA的功能,1抗生物胁迫植物中存在一类miRNA与多种植物病毒基因完全或不完全互补，推测这类miRNA可通过切割病毒基因抑制病毒侵染。2抗非生物胁迫21抗营养胁迫(1)调节植物磷代谢平衡Chiou发现，在磷胁迫下，拟南芥中miR399大量表达；而在高磷条件下，未检测到miR399的表达。(2)调节植物硫代谢平衡miR395在高硫条件下不表达，在硫缺失胁迫下表达。,植物miRNA的功能,2抗非生物胁迫22抗环境胁迫miRNA可以使植物抵抗寒冷、高浓度ABA、干旱、高盐等极端自然环境及抵抗环境引起的自身氧化胁迫。,miRNA的检测,miRNA的获取miRNA的确认miRNA的检测方法,miRNA的获取,miRNA分子的序列短小1）在基因组中存在较多的互补序列2）在不同生物体内与靶基因结合的方式也不尽相同3）通常与多种蛋白相互作用这使得建立一个有效而且普遍适用的研究方法异常困难。#到目前为止,miRBase上公布的miRNA总数将近3000种。#现在已知靶基因的miRNA多是通过基因克隆和生物信息学筛选的方法发现的。,miRNA的获取基因克隆,1.1基因克隆直接克隆的方法通常是从总RNA中提取大约22nt的小RNA分子,制备一个小RNA的cDNA(complementaryDNA)文库。将文库中的小RNA序列与基因组数据库中BLAST序列类似性比对,排除非miRNA序列后,通过Northern印迹方法(Northernblotting)得到最终确认。目前大量的已知miRNA都是通过这种方法获得的。基因克隆方法的优点是对于高丰度或常表达的基因来说,可以获得完整的miRNA序列。然而对于另一些miRNA,它们在生物体内浓度很低(表达量低或表达产物极不稳定,或前体到成熟的加工效率低等原因引起),或者某些只在生物体的特定时期或特定组织器官中表达,直接克隆法则无法获取。注：Northern印迹杂交（Northernblot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。,miRNA的获取生物信息学筛选,1.2生物信息学筛选随着生物全基因组测序的完成,利用计算机对基因组序列进行搜索可以大大提高miRNA的鉴定效率。所以,人们根据目前已知的miRNA基因序列总结它们的特征和规律,编写了一些计算机程序,通过对生物基因组数据库进行搜索,可以找到那些可能为miRNA的基因序列,然后通过Northernblotting来筛选真正的miRNA基因。生物信息学方法是依据在不同的物种中，其成熟的miRNA具有较大的序列同源性以及前体的茎环结构具有相当大的保守性这一特征在基因组数据库中搜索新的miRNA基因。该方法根据比较基因组学原理并结合生物信息软件在已测序基因组中进行搜索比对，根据同源性的高低再进行RNA二级结构预测，将符合条件的候选miRNA与已经通过实验鉴定的miRNA分子进行比较分析，最终确定该物种miRNA的分布及数量。近年来随着miRNA预测方法的不断发展，人们发现的miRNA数量呈几何级数增长。这些预测方法从简单的序列比对搜索发展到现在的机器学习算法，程序设计越来越智能化，复杂化。,miRNA的获取生物信息学筛选,随着人miRNA基因转录出的pri-miRNA迅速加工成具有茎环结构的pre-miRNA，随后被切割成miRNA：miRNA*双体，并被选择性地组合进核糖核酸沉默诱导复合体（RISC）并进行靶基因识别。在相似的物种中，miRNA是很保守的；但在相距较远的物种间，miRNA又有一定的分歧，尤其体现在pre-miRNA上。这些miRNA功能作用机制的阐明为预测软件的研发提供了理论依据，但仍需要不断修补和完善。近年来，几个基于这些规则的miRNA预测程序先后被开发（下表），并被广泛使用。生物信息学手段可以说是一种更高通量的方法。通常有以下几种方法:Mirscan是一种基于二级结构的预测程序,通过扫描两种系之间是否存在同源的茎环结构,应用于检测脊椎动物和线虫的候选基因。,miRNA的获取生物信息学筛选,Mirseeker是一种检查RNA序列茎环结构的预测程序,应用于筛选昆虫的候选基因。它是根据3个标准来预测的:一是具有长度为70100nt茎环结构的Pre-miRNA;二是不同种系生物中Pre-miRNA的保守性;三是miRNA的核苷酸差异性。ERPIN是一种类似于BLAST的校对程序,用于搜寻动物基因组中与miRNA序列类似的序列。MiPred可以通过randomforest预测模型和miRNA特征的结合,区分miRNA的真正前体和假冒前体。,miRBase序列数据库,miRBase序列数据库是一个提供包括miRNA序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。miRBase提供便捷的网上查询服务，允许用户使用关键词或序列在线搜索已知的miRNA和靶标信息，详情请（/）。2012年8月1日正式发布。相比于以往版本的数据库（SangermicroRNA序列数据库），19.0版数据库进行了巨大的数据更新：miRNA发夹前体序列已升至21264条，新增3171条；成熟miRNA升至25141条，新增3625条；已发布的miRNA序列共涵盖193个物种，相比于18.0版新增25个物种。新版数据库对miRNA序列注释和命名进行了系统的修正，miR*命名已经终止使用，取而代之的是-5p和-3p的命名法。,miRNA的确认,判断标准:能够通过与特定大小的总RNA样品杂交得到22个碱基对(22nt)的产物(即需要Northern杂交或引物延伸反应验证表达)。所得的序列是从特定大小的(22nt)的小分子RNA库中克隆到的,并且必需与克隆的来源物种的基因组序列完全匹配。经过前体的二级结构预测,有发夹状的二级结构,并且成熟的miRNA序列在发夹的一条臂上。成熟的miRNA序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性。在Dicer突变的系统中,前体的积累增多。要确认基因克隆获得的或生物信息学分析预测的基因是否为真正的miRNA,就应该采用上面5个原则来检验。,miRNA的检测方法,要了解miRNA在基因调控中扮演的角色,很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测miRNA基因的表达。检测miRNA的方法主要有以下几种:Northernblotting是现在检测miRNA表达最主要的手段,所有克隆和生物信息学分析得来的miRNA都需要经过Northernblotting来验证和确认。这种方法的缺点在于灵敏度较低且不能进行高通量的检测。,miRNA的检测方法,RT-PCR（reversetranscriptionPCR，反转录PCR）也被用来检测miRNA前体的表达水平,但miRNA前体的表达水平并不一定和成熟miRNA的表达水平一致。因此,在RT-PCR的基础上,人们改进了一些技术,从而使得能够检测低表达量的miRNA。实时荧光定量PCR(real-timePCR)可以很精确的定量分析miRNA的表达,也经常用于验证预测的miRNA。引物延伸法,就是在引物的5末端加一个特异标记,可以定量测定低丰度的RNA含量。原位杂交技术,可以方便的检测miRNA的时空表达的差异。原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。另有荧光原位杂交。,miRNA的检测方法,芯片技术(mi-croarray)是一种更快、更广泛、更有前途的研究miRNA表达的方法。Liu等最先发表了关于微点阵能够获得高通量的结果。这些结果显示了组织特异性miRNA的表达标记,而且通过Northernblot和real-timePCR进行了验证。芯片技术固然以其高通量和并行处理的特点在基因信息分析中占据重要地位,但信息量大并不等于质量高。实际上,基因芯片的一个突出弱点就是其信息质量的稳定性和可重复性比较差,且无法实现定量检测,因此后来又出现了多种改进的芯片技术,其中现在流行的就是液相芯片技术。液相芯片(liquichip)是美国纳斯达克上市的Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术,它既能为后基因组时代科学研究提供强大的技术支持,又能提供高通量的新一代分子诊断技术平台。,miRNA的识别,多个研究小组采用生物化学结合是生物信息学的方法开展对miRNAs的研究工作。由于据推测都是由Dicer酶降解RNA得到的，2123个碱基大小、有5端磷酸基和3羟基的RNA片断，有的实验室采用改良的定向克隆方法来筛选具有相同特征的小分子1.筛选一定大小的RNA分子，连接到3和5的适配子(adapters)2.逆转录3.通过PCR扩增4.亚克隆5.测序。,在分子克隆中指从大片段的克隆中选取特定小片段再克隆/subclone,miRNA前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进行。这个方法有助于判断miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解产物。生物信息学的方法被鉴别出来，已经鉴别出来的miRNAs只不过是沧海一粟，由于很多已经鉴别出来的miRNAs是从单个克隆中鉴别出来的，所以可以假设还有很多miRNAs在分离和鉴定过程中被“漏掉”了，测序工作还远远不够。,miRNA的靶基因,miRNA的靶基因预测miRNA的靶基因检测miRNA的生物学功能,miRNA的靶基因预测,以前,研究miRNA的靶基因依赖于正向遗传学方法,包括突变体的产物、变形筛选、定位克隆和miRNA及其靶基因的确认,如lin24和let27及它们的靶基因的发现。在果蝇中,miRNAbantam及其靶基因hid的发现就是正向遗传学研究miRNA的经典过程。反向遗传学联合生物信息学的方法比正向遗传学更优越。它主要是由软件来预测miRNA的靶基因并为分子实验提供指标，其基本原理是基于miRNA与其靶基因的自然配对。已知miRNA及其靶基因之间的对比和相关性,lin24、let27和bantam基因的确认等都为计算机程序发展提供了更多的信息。计算机程序预测方法在植物种属中运用的很成功,而在动物中则不是很成功,这可能是因为植物中的miRNA与其靶基因几乎完全配对结合。而在动物中,miRNA与靶基因mRNA通常以不精确的碱基互补配对结合。,miRNA的靶基因预测,miRNA的研究意义之重大是毋庸置疑的。然而，与新的miRNA的频频发现相比，miRNA的功能研究相对缓慢。到目前为止，在发现的4449多个miRNA中，确定功能的miRNA仅有几十个。导致miRNA功能研究进展缓慢的非常重要的原因是miRNA的作用靶标难以确定。通过实验方法确定miRNA的作用靶标非常耗时，目前尚无高通量的靶标鉴定方法。因此，通过理论方法预测miRNA的作用靶标成为当前识别miRNA作用靶标的较为理想的途径。以下重点介绍几种经典预测软件的算法分析，其他软件（见下表）：,miRNA几种常见的预测方法,下面概括介绍几种常见的预测方法：()miRanda.miRanda是最早的一个利用生物信息学对miRNA靶基因进行预测的软件,由Enright等人于2003年设计开发.其对3UTR的筛选依据主要是从序列匹配、miRNA与mRNA双链的热稳定性以及靶位点的保守性三个方面进行分析.miRanda软件首先选取了黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中已知的73条miRNA作为探针,采用类似于Smith-Waterman的算法对9805个3UTR进行碱基互补分析.首先,互补参数被设定为:GC,AU为+5,GU为+2,其他配对方式为3,同时起始空位(gap-opening)罚分为8,延伸空位(gap-extension)罚分为2;*序列比对就是通过一定的算法对两个或多个序列进行比较,找出序列间最大的相似性匹配。*Smith最后,miRNA与靶mRNA的互补还要遵循以下4个规则:miRNA第24位碱基和靶基因精确匹配;第312位碱基和靶基因错配不得多于5个;9L-5(L为miRNA总长)位碱基最少一个错配;最后5个碱基错配不得多于2个.,miRanda,在热稳定性方面,miRanda采用Vienna软件包计算miRNA与3UTR作用的自由能(G).在物种间保守性方面,要求靶位点在多物种3UTR比对中相同位置处碱基相同.综合以上3条原则,miRanda选取每条miRNA相对的3UTR中排名前10位的基因,作为miRNA的候选靶基因,对于多个miRNA对应于同一靶位点的情况,miRanda则使用贪心算法(GreedyAlgorithm)选取其中得分最高且自由能最低的那一对.,TargetScan,()TargetScan和TargetScanS.TargetScan是Lewis等人在2003年开发的一款用于预测哺乳动物miRNA靶基因的软件,该软件将RNA间相互作用的热力学模型与序列比对分析相结合,预测不同物种间保守的miRNA结合位点.与miRanda不同,在TargetScan的算法中,要求miRNA5端第28位碱基与mRNA的3UTR完全互补,这7个核苷酸被称作“miRNA种子区/关键区”（seedregion）.种子区向两侧延伸直到出现碱基错配为止,这期间允许GU配对,同时利用RNAFold计算结合位点的自由能.TargetScan中引入了信号噪声比来评估预测结果的准确度,所谓信号噪声比即用已知(信号组)和随机生成的miRNA(噪声组)分别对mRNA的3UTR进行预测,所得靶基因数目的比值.,当仅针对人(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)的3UTR对miRNA靶位点进行预测时,信号噪声比为21针对人、小鼠、大鼠(Rattusnorvegicus)的3UTR进行预测时信号噪声比为3.21研究范围扩大到人、小鼠、大鼠和河豚(Takifugurubripes)时,信号噪声比为4.61.随着物种数目的增多,预测得到的靶基因减少,但准确性得到了相应的提高.,TargetScanS,后来,Lewis等人又对TargetScan进行了优化,即TargetScanS.TargetScanS在人、小鼠、大鼠的基础上增加了狗(Canisfamiliaris)和鸡(Gallusgallus)的基因组数据,同时在算法上做了改动,将种子区由先前的7个核苷酸调整为5端第27位碱基共6个核苷酸,要求在种子区完全互补的情况下,miRNA第8位碱基与靶基因互补或者miRNA第1位碱基是腺嘌呤.2007年,Andrew等人又将TargetScanS的算法中加入了新的条件1）即有效的miRNA结合位点多分布于3UTR中AU富集的区域2）功能上具有协同作用的miRNA靶位点相近3）miRNA的第1217个核苷酸与3UTR互补促进两者的结合4）有效的miRNA结合位点优先分布于3UTR的两侧,但距离终止密码子至少15个核苷酸.,动物中靶基因预测方法,扩展,miRNA命名物种缩写癌基因和相关miRNA的特征基因数据库Blast简介cancergeneticswebmiRanda应用,miRNA命名,(1)miRNA简写成miR-No.,它的基因简写成mir-No.如miR-21；(2)高度同源的miRNA在No.其后加英文字母(小写,一般从a开始)如miR-199a和miR-199b；(3)由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，则在后面加上阿拉伯数字以区分,如miR-199a-1和miR-199a-2；(4)如果一个前体的2个臂分别加产生miRNA，则根据克隆实验，在表达水平较低的miRNA后面加“*”，如miR-199amiR-199a*，或进行如下命名，miR-142-5p(也可命名为miR-142-s，表示从5端的臂加工而来)和miR-142-3p(也可命名为miR-142-as，表示从3端的臂加工而来)；(5)将物种缩写置于miRNA之前，如hsa-miR-195；(6)确定命名规则之前发现的miRNA，如let-7，则保留原来名字。,物种缩写,http/www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/guidelines.htmlhsa:Homosapiens,人mmu:Musmusculus,小家鼠rno：Rattusnorvegicus大鼠cfa：Canisfamiliaris狗gga：Gallusgallus鸡dan、der、dgr、dme（黑腹果蝇）、dmo、dpe、dps、dse、dsi、dvi、dwi、dya：果蝇（不同种属）,癌基因和相关miRNA的特征,大量关于癌症的相关研究证实在癌症患者体内确实存在着某些异常表达的miRNA值得研究的是癌症患者体内已发现的异常表达的miRNA几乎全部作用于癌症患者的癌基因上从这个角度看，miRNA在癌症的发生过程中，特别是对癌基因的基因调控，抑制蛋白质表达方面应该起着非常重要的作用因此，研究癌症与miRNA的关系具有非常重要的生物学意义。,癌基因和相关miRNA的特征,癌症患者体内存在的某些与癌症有密切关系的蛋白质，其出现与癌基因的激活有密切关系，因此研究蛋白质的结构域与miRNA的关系也非常有意义。目前研究的RNAi技术可在体外培养细胞中沉默人类的内源性基因，使得RNAi技术可能进入肿瘤治疗领域。利用RNAi技术封闭恶性细胞中的癌基因成为高特异性治疗癌症的新希望。,miRNA预测主要遵循原则,主要遵循以下几个常用原则:()miRNA与其靶位点的互补性()miRNA靶位点在不同物种之间的保守性()miRNA-mRNA双链之间的热稳定性()miRNA靶位点处不应有复杂二级结构()miRNA5端与靶基因的结合能力强于3端.,区别：miRNA与mRNA的3端结合,靶基因的检测方法,目前由于miRNA相关研究开展时间不长，可以辅助或实现miRNA靶基因鉴定的生物实验方法种类不多，总结起来主要有：DNA微阵列实验（DNAmicroarray）、免疫印迹（Westernblot）、报告基因检验（reportgeneassay）、靶位点突变实验、免疫沉淀反应实验（immunoprecipitation，IP）、蛋白质谱分析实验（massspectrometry）。与miRNA靶基因的预测方法相比,对miRNA靶基因进行实验验证的方法并不多,目前还没有一个快速、简便、高通量的鉴定方法.,靶基因的检测方法,最直接的鉴定方法是,利用荧光定量PCR及Westernblot方法分别检测转染(水平升高)或敲低(水平降低)miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化,从而确定miRNA与靶基因的对应关系.这种方法能够直接鉴定出miRNA的靶基因,准确度高但不能鉴定miRNA的靶位点.目前最为常用的miRNA