课题3　分解纤维素的微生物的分离

课题3分解纤维素的微生物的分离,1、纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖。2、可被土壤某些微生物分解利用。,课题背景,草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？,胃中生活着大量分解纤维素的微生物，能产生纤维素酶，将纤维素分解成葡萄糖。而人没有分解纤维素的能力。,葡萄糖苷酶,纤维素酶是一种_，它包括_、_和_，具有催化分解纤维素的作用。,复合酶,C1酶,CX酶,棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成，请完成下列过程：,基础知识,（一）纤维素与纤维素酶,取二支20mL的试管,实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。,思考1实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？,下列生物能分解纤维素的是（）人兔牛蘑菇纤维杆菌,A.B.,C.D.,C,方法,-选择培养基,以纤维素为唯一碳源,-刚果红染色法,红色复合物,红色消失，出现透明圈,（二）纤维素分解菌的筛选,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A.刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,实验设计,土壤取样,选择培养*,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落,什么样的环境取样?,培养的目的?选择培养基的特点?,挑选什么样的菌落?,鉴别培养基的特点?如何鉴别?,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。,分布环境,1、土壤取样：,富含纤维素的环境中,操作步骤,实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,2、选择培养,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,制备选择培养基：,操作：,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,培养基成分分析,说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,A、给出的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有选择作用，本配方中纤维素粉作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。,C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,旁栏思考题为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌培养在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101107倍。,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,（1）制备鉴别培养基:,（2）涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),【资料三】刚果红染色法,方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：在倒平板时就加入刚果红,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便，不存在菌落混杂问题,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,思考：这两种方法各有哪些优点与不足,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,挑选产生透明圈的菌落,挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C370C培养，可获得纯培养。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_发酵和_发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_含量进行定量测定。,课题延伸,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法后置染色法,富含纤维素土壤,增加分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,D,1、下列材料中纤维素含量最高的是()A杨树B小麦C玉米D棉花,C,2、纤维素酶能够分解()A纤维素的微生物B淀粉的微生物C纤维素D淀粉,3、刚果红能与哪项物质形成红色复合物()A纤维二糖B纤维素C葡萄糖D麦芽糖,B,B,4、寻找纤维素分解菌应到()A湿润的环境中B富含纤维素的环境中C富含无机盐的环境中D池塘中,5、纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有()ANaNO3BKClC酵母膏D纤维素粉,D,2009年40.【生物选修1生物技术实践】（15分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。,温度,酸碱度,易培养,生活周期短,灭菌,消毒,损伤DNA的结构,链接高考,（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。,比例合适,鉴定（或分类）,将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生.,灭菌,11年39.【生物选修1：生物技术实践（15分）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于