水稻品种DNA指纹检测及其应用

水稻品种SSR指纹图谱及其应用,实验目的,学习SSR指纹图谱的构建原理与方法应用SSR指纹图谱进行水稻品种的鉴别,实验原理,1、生物具有丰富的遗传多样性，并在个体形态上表现出千姿百态。2、DNA分子标记技术的发展，使得在DNA分子水平揭示生物的遗传多样性成为可能。（稳定性好、不受环境和发育时期限制等多方面优越性）3、DNA指纹图谱（条码技术）能有效鉴别不同生物物种或同一物种的不同基因型。4、常用的几种DNA分子标记：1）RFLP2）AFLP3）RAPD4）SSR,5）SCAR：sequencecharacterizedamplifiedregion6）CAPS：cleavedamplifiedpolymorphicsequence7）InDel,SSR分子标记的原理：SSR序列特征：如：(AG)n,(AG)n,n=36,(AG)n,n=112,(AG)n,n=75,SSR的PCR扩增及电泳检测一般为共显性，在F2群体中，理论上A：AB：B=1：2：1,ABABBABA,标记等位基因的识别与标识,RM267多态性,RM522单态性标记,RM552多态性,ABC,ABDC,表1不同基因型SSR指纹图谱示例,影响指纹图谱特异性的主要因素：1、生物内在的遗传多样性2、标记的多态性3、标记的数目,应用SSR指纹图谱鉴定杂交稻真假杂种的实例,Ref：彭锁堂、庄杰云、颜启传、郑康乐.我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定.中国水稻科学,2003,17(1):15,SSR标记RM17对杂交稻“两优培九”100粒单种子的扩增结果(M分子量Marker，A不育系，R恢复系，2轮点样）,实验材料,1、2个杂交稻品种及其4个亲本品种1）红莲优6号（粤泰A/扬稻6号）2）两优培九（培矮64S/93-11）3）P14）P25）P36）P42、6个SSR标记（见右表）3、分组：1）4人一组，用2个标记分别对6个水稻品种进行PCR扩增2）每3个小组的实验结果整合到一起，用于实验报告的撰写,实验方法,反应因子单个反应体积（l）9个反应用量（l）1、ddH2O10.090.02、10buff2.018.03、25mMMgCl21.816.24、10mMdNTPs1.09.05、5uMprimer2.018.06、5U/ulTaq酶0.21.8(分装前先离心)7、DNA模板3.0,1、PCR反应体系配制：在0.5ml离心管中配制反应混合液,1)先按9个反应所需量配制因子1-6的混合液，瞬时离心混匀2)将混合液分装到6个反应管中，每管17l3)向每管分别添加6个水稻品种的DNA模板，4)再向每管各加1小滴矿物油，瞬时离心5)按标记（每标记1列）将反应管安放到PCR仪上,每个标记分别在1个0.5ml离心管中配制反应混合液,94预变性5min94变性1min55退火1min72延伸1min重复步骤-35次72延伸10min注：退火温度对扩增产物的影响？,2、PCR扩增程序,1）制胶：用1TAE液配制4%琼脂糖凝胶70ml+10ulGoldViewer2）点样：每管加入2ul溴酚兰加样缓冲液，瞬时离心。取10ul扩增产物点样(请注意点样顺序)3）电泳：稳压（100V），电泳1.5h4）观察：紫外灯下观察电泳结果,3、琼脂糖凝胶电泳,多态性标记的筛选,4、实验结果分析,6个多态性标记构建的水稻品种SSR指纹图谱,请利用不同品种的SSR指纹图谱判断P5、P6杂交种的亲本来源,特别提示实验报告务必有图片,PCR试剂准备,1、每3个小组（12人）共用1套试剂（实际反应数3