HPLC高效液相色谱技巧

如何用好HPLC得到好结果的技巧!,流动相缓冲液/溶剂选择,梯度优化,流速选择脱气，流速稳定,流动相制备柱高柱效,二级作用力,柱间变异,温度控制检测灵敏度,选择性,温度波动影响样品提取方法选择,样品溶剂选择,氧气影响仪器性能,稳定性,耐用性,易操作性综合评估分析技术的稳定性,可靠性,定量准确性,HPLC如何得到好的结果,流动相溶剂混和率及其制备(1),下面的两种配制一样吗?水/乙醇=1/1(v/v)50%(v/v)乙醇水溶液,*混和有机溶剂时注意体积变化混和液的密度不是两种溶剂密度的简单相加.25C时，50mL水和50ml乙醇混和,最终体积为96ml.,水/乙醇=1/1(v/v)分别量取500ml水和乙醇,然后混和混和体积不是1L.,50%(v/v)乙醇水溶液.加500ml乙醇于1L的容量瓶中,加水至刻度.水的比例更高.,流动相溶剂混和率及其制备(2),流动相A:20mM磷酸(Na)缓冲液/乙腈=9/1(v/v)流动相B:10%(v/v)乙腈/20mM磷酸缓冲液,1,2,3,3,1,A,B,2,Peaks1:acetaminophen2:dihydrocodeine3:caffeine,0,2,4,6,8,10,min,Column:Shim-PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Flowrate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS(210nm),流动相溶剂混和率及其制备(3),配制:20mM磷酸缓冲液(pH2.5),流动相缓冲液比例及其制备(1),A:“20mM”表示磷酸浓度加10mmol磷酸和10mmol磷酸二氢钠,溶解于1L水中B:“20mM”表示钠浓度溶解20mmol磷酸二氢钠于1L水中,加磷酸调pH至2.5C:“20mM”表示磷酸和钠的浓度,用高氯酸调节pH溶解20mmol磷酸二氢钠于1L水中,用高氯酸调节pH至2.5,Column:Shim-PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Flowrate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS(210nm),流动相A:磷酸浓度为20mM流动相B:钠浓度为20mM流动相C:磷酸，钠浓度均为20mM,用高氯酸调节pH,流动相缓冲液比例及其制备(2),min,1,2,3,3,1,A,B,2,Peaks1:acetaminophen2:dihydrocodeine3:caffeine,0,2,4,6,8,10,C,3,1,2,不一样的解释Dihyrocodeine出峰位置不一样,流动相缓冲能力弱pKa与流动相pH相近的酸和碱的峰形变差.,Column:STRODS-II(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobile:20mMbuffersolution(pH4.5)phase/acetonitrile(3/1,v/v)Flowrate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS(240nm),左图:柠檬酸缓冲液pH(4.5)作流动相右图:磷酸缓冲液(pH4.5)作流动相,流动相pH缓冲能力和峰形,吸光度HPLC级的乙腈在UV低波长有很低的吸收HPLC级的乙腈适用于UV低波长下高灵敏度的分析!柱压乙腈更低.相同流速下,引起的柱压更低.洗脱能力乙腈更强.一些化合物甲醇容易洗脱.(胡萝卜素,胆固醇)选择性不同.峰形不同.聚合物基底的柱子,乙腈更好.流动相脱气效率与水混和时要注意甲醇发热气体溢出乙腈吸热气体溶解,流动相甲醇和乙腈的不同,保留时间改变峰面积改变定量错误!对绝对量响应的检测器流速不影响峰面积.对浓度响应的检测器流速影响峰面积.*几乎所有的LC检测器均为浓度型检测器,流动相流速变化的影响(1),Column:Shim-PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobilephase:methanol/water=6/4(v/v)Flowrate:A;1.00mL/minB;0.99mL/minTemperature:40CDetection:UV-VIS(260nm),流动相流速变化的影响(2),两台泵进行混和时,A,B,A:一台泵输送预先混和好溶剂B:两台泵分别输送两种溶剂并混和,Peaks1:methylparaben2:ethylparaben3:propylparaben,1,2,3,流动相高压梯度时流速变化的影响(1),保留时间和预先混和好的溶剂不同,Column:Shim-PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobilephase:methanol/water(6/4,vol/vol)Flowrate:1.00mL/minTemperature:40CDetection:UV-VIS(260nm),流动相高压梯度时流速变化的影响(1),A:一台泵输送预先混和好溶剂B:两台泵分别输送两种溶剂并混和,气泡出现的原因当溶解的空气超过空气的溶解度时.原因:溶剂温度升高,压力降低,溶剂混和等.气泡可能引起的问题流动相,泵保留时间波动,流动相流量不稳定柱峰变形,柱效降低检测器产生噪声解决方法:离线和在线脱气然而,问题不仅由于气泡引起,而且由于溶解的空气引起.,流动相流动相中的气泡引起的问题,荧光检测器氧气引起荧光猝灭改变峰面积吸光型检测器改变背景吸收基线波动(特别是在梯度洗脱时)氧气吸收峰出现示差折光检测器基线波动,流动相流动相中的空气对检测器的影响,*荧光检测器分析bisphenolA脱气:氦脱气,流动相荧光检测中脱气的影响(1),流动相脱气可能影响荧光检测的灵敏度.,脱气时间对气液半透膜脱气效果的影响.,Column:Shim-PackVP-ODS(150mmLx4.6mmI.D.)MobilePhase:acetonitrile/H2O=4/1(v/v)Flowrate:1mL/minTemperature:40C,Analyte:PyreneDetection:Fluorescence(Ex310nm,Em390nm)Degassing:Gas-liq.separationmembrane,流动相荧光检测中脱气的影响(2),甲醇吸收光谱图,如果溶解的氧气浓度高，有机溶剂的吸光度液也高.在短波长区影响更为明显.,流动相UV检测器的背景变化,饱和空气,脱气,进流动相引起出峰!?,流动相溶解的空气引起UV检测器的出峰,Detection:UV-210nm,流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰,流动相脱气,流动相没脱气,OxygenbubblingAirsaturationHebubbling,OxygenbubblingAirsaturationHebubbling,放大,流动相溶解空气引起的RID检测器出峰,Column:SCR-101CMobilephase:WaterFlowrate:0.5mL/minTemperature:85CDetection:RIDdetectorDegasser:Gas-liq.MembraneSepar.(DGU-14A)Sample:0.5%mannitol,流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰.,一般,环境温度影响光谱图的形状.,波长,高温下的光谱图,由于温度变化引起的吸光度差异,低温下的光谱图,吸光度,检测UV检测器池温度的影响(1),不控制温度时峰面积比较(34C),Column:Shim-PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobilephase:10mMaceticacid(sodium)buffersolution(pH4.5)/Methanol=7/3,(v/v)Flowrate:1mL/minTemperature:40CDetection:UV-VIS(260nm),检测UV检测器池温度的影响(2),无温度控制(RF-10AXLsuper),2025C面积降低了13.5%,2025C面积降低了2.2%,检测池温度对荧光检测器的影响(1),正常情况下,温度越高,荧光灵敏度越低.,氮蒽分析结果(温度对荧光灵敏度的影响),无温度控制(RF-10AXL),仪器:Shimadzu氨基酸分析系统(用OPA作柱后衍生)检测:RF-10AXLSuper(Ex350nm,Em450nm)(池温度;20C,40C),检测池温度对荧光检测器的影响(2),BisphenolA在各种溶剂中的荧光光谱(激发波长270nm,使用背景校正),检测溶剂对荧光灵敏度的影响,甲醇,乙腈,波长,不冷却时,抗坏血酸逐渐降解.,柱:SCR-101N(250mmL.x7.9mmI.D.)流动相:10mM草酸钠缓冲液(pH3.8)，含有1mMEDTA2Na流速:1mL/min温度:40C检测:UV-VIS(245nm),抗坏血酸峰面积的变化,样品冷却可以防止样品降解,冷却,未冷却,样品样品溶剂对峰形的影响(1),*水/甲醇作流动相的反相色谱,不同样品溶剂对理论塔板数的影响.,水溶剂,甲醇/H2O,甲醇溶剂,样品:10ul咖啡因柱:Shim-packCLC-ODS(150mmL.x6mmI.D.)流动相:甲醇/H2O=3/7流速:1mL/min温度:室温.检测:270nm,理论塔板数,进样体积,左图.:样品溶剂水/乙腈=3/1(v/v)右图.:样品溶剂-乙腈,Column:STRODS-II(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobile:20mMcitricacid(sodium)bufferPhase:solution(pH4.5)/acetonitile=3/1(v/v)Flowrate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS(240nm),样品样品溶剂对峰形的影响(2),如果样品溶剂比流动相强,峰形恶化.,提高分析的准确度离线前处理很难保证完全一致,可能降低准确度简化操作离线处理需要很强的技能提高处理效率晚上也能进行自动前处理,可以极大的提高处理效率,样品自动样品前处理的优点,样品HPLC柱切换系统血样直接进样(Co-SenseforBA),泵,分析柱,自动进样,反相内表面预处理柱Shim-PackMAYI-ODS,泵,检测器,流动相,流动相,稀释流路,药物和内表面示意图,蛋白,异丙基肾上腺素,进样体积:100L流动相(进样路):0.1%磷酸/乙腈=95/5(v/v)检测:异丙基肾上腺素；275nm血浆基质；280nm,样品用Co-Sense对生物样品分析进行自动样品前处理,添加了异丙基肾上腺素的血浆分析,血浆中分别添加2mg/mLketoprofen和naproxen的回收率比较(50mL进样.),手动预处理(添加乙腈),用Co-Sense进行自动预处理,样品不同预处理方法的回收率比较,原因:由于离子作用力或配位异构力引起的对金属离子的吸附(离子或者碱性化合物)清除吸附的化合物（洗针）控制吸附产生（使针惰性化）原因:由于树脂氢键力引起的吸附(脂溶性化合物)使用有机溶剂清洗转子密封槽改变转子密封材料来降低吸附,样品过载的原因及控制,使用自动进样器时交叉污染的原因及控制手段,清洗此表面是重要的,针,清洗状态,进样状态,样品环,泵,柱,洗针口,针,针密封,样品洗针机理(全量进样),若控制由于离子作用力或配位异构力引起的对金属离子的吸附(离子或者碱性化合物)酸化.大浓度的配位离子作离子对试剂.(例如)100mM高氯酸水溶液/甲醇(或乙腈)由于疏水作用力引起的化合物吸附(树脂型化合物)有机溶剂清洗.*(例如)100%甲醇,乙腈,THF等.,样品洗针溶剂的选择,被分析物:氯乙醇(碱基化合物)进2L的标准溶液(含有1.2mg/ml溶解化合物的流动相),连续注射2L的流动相,比较面积.,柱：Shim-packVP-ODS(150mmL.x2.0mmI.D.)流动相：含有100mMNaClO4的10mM磷酸缓冲液(pH2.6)/乙腈=55/45(v/v)流速：0.2mL/min温度：40C检测：UV(260nm，usingsemimicrocell),样品降低由于碱性物质引起的交叉污染(1),针密封:SUS清洗液:流动相洗针程序:在洗针口浸洗3sec.吸样品液.在洗针口浸洗3sec.进样.,不同惰性化SUS针密封方法的比较,浸入洗液3sec.其他条件同上页相同.,样品降低由于碱性物质引起的交叉污染(2),进2L流动相的色谱图,样品降低由于碱性物质引起的交叉污染(3),在分析氯乙醇时(碱基化合物),通过浸洗针和针表面特殊的金属涂层，交叉污染从0.07%降低到0.001%!(随着化合物种类,浓度和进样体积变化而变化),进2L标准溶液的色谱图,*色谱图纵坐标的满刻度不一样.,chlorohexidin,chlorohexidin,疏水性化合物吸附被认为主要在通过样品的转子密封槽.由于流动相一直在洗这些吸附物,污染会逐渐流出.,样品降低由于疏水物质引起的交叉污染(1),被分析物:VitaminAAcetate进10L的标准溶液（10g/mL:甲醇溶解）,然后进10L的空白溶液(甲醇),并比较峰面积.,柱:Shim-PackFC-ODS(75mmL.x4.6mmI.D.）流动相:(A);水,(B);甲醇0-2min,B溶液75%,保持2-5min,Bsolution75-100%,线性梯度5-10min,B溶液100%,保持流速:0