《DNA测序方法》PPT课件

DNA测序原理与方法,DNA测序：是对DNA分子的一级结构的分析。其基本原理是DNA的复制反应体系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿35的方向移动，dNTP按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3-OH末端。,双脱氧链终止法测序化学降解法测序自动化测序基因芯片测序,双脱氧链终止法测序(thechainterminationmethod)基本原理：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。,用于终止反应的双脱氧核苷酸：将2，3双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。,Maxam-Gilbert化学降解法测序基本原理：将一个DNA片段的5端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。,硫酸二甲酯dimethylsulphate，DMS，（CH3O）2SO2是一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N甲基化，但是鸟嘌呤G的N甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。,哌啶甲酸可以使DNA链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致DNA链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。肼，又称联氨NH2.NH2，在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置，导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2MNaOH），肼则主要作用于胞嘧啶C，使之断裂。作为标记用的放射性同位素主要有-32（-32ATP，-32GTP.-32TTP，或-32CTP）。,Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。Sanger法需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。随着M13噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。,自动化测序,基本原理：与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddTTP标记绿色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.,芯片测序原理：杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了已知序列的八核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCA