微生物学试验ppt课件

.,1,微生物学实验LabworkonMicrobiology,实验指导教师：涂璇,.,2,实验室规章制度及实验基本要求,1.遵守实验室规则，爱护实验仪器设备。2.实验前要写预习报告，了解目的、原理和基本方法，做到心中有数、思路清晰。3.进入实验室要签名，指导老师检查预习报告。4.实验操作要细心谨慎，严格遵守操作规则，认真进行观察，做好实验记录。5.以实事求是的态度认真完成实验报告，并交给指导教师批阅。6.随时注意实验台面的清洁，做完实验要清理好实验台面，卫生值日生要做好当日的清洁卫生。7.指导老师检查实验记录和实验任务，检查通过签字后方可离开实验室，走时注意关闭灯、电、火、窗。,.,3,实验考核,1.微生物学实验成绩包括实验过程表现成绩、实验报告成绩2.实验过程表现成绩包括：实验操作是否正确规范、学习态度是否认真、实验结果如何是否符合逻辑、清扫值日等方面。成绩分为：良好、一般、差三级，相当于百分制85、75、55。3.实验报告成绩包括：实验报告的格式是否正确、原理是否论述清楚，实验结果分析讨论是否正确，报告字迹是否清楚等方面，实验报告给定成绩分为：A+、A、A-、B+、B、B-、C+、C、C-九级，相当于百份制的95、90、85、80、75、70、65、60、55。,.,4,微生物实验进程表,实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色实验二实验室环境、人体表面微生物检查及常用器皿包扎实验三细菌的芽孢和荚膜染色及观察实验四培养基的制备、分装与灭菌实验五放线菌、霉菌形态观察实验六微生物分离纯化技术实验七酵母菌形态观察及死活细胞鉴别和显微镜直接计数实验八平板菌落计数与接种实验九土壤微生物分离纯化实验十环境因素对微生物生长的影响实验十一微生物生理生化实验实验十二水中细菌总数和总大肠菌群的测定,.,5,显微镜实验室规则及要求,实验前要预习，写好预习报告。保持室内整洁，不要随意走动。如若发生意外，及时报告老师。作好实验记录，写好实验报告。对于实验材料，写好姓名组号。牢记无菌概念，保持清洁卫生。上课认真听讲，课后积极讨论。上课不许闲聊，不得随意走动。注意实验安全，祝你实验顺利。,.,6,实验一、显微镜的使用以及细菌简单染色和革兰氏染色,普通光学显微镜的使用细菌简单染色和革兰氏染色,.,7,1普通光学显微镜的使用,1.1目的要求学习并掌握油镜的原理和使用方法1.2实验材料显微镜擦镜纸香柏油标本,.,8,1.3原理,1主要光学显微镜种类,显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，是人类进入原子时代的标志。主要用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器。显微镜分光学显微镜和电子显微镜。现在的光学显微镜可把物体放大1600倍，分辨的最小极限达0.1微米。,目前光学显微镜的种类很多，主要有明视野显微镜（普通光学显微镜）、暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、激光共聚扫描显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜。,电子显微镜有着比光学显微镜高得多的对物体的放大及分辨本领，它将电子流作为一种新的光源，使物体成像。目前电子显微镜包括：透射电镜，扫描电镜，分析电镜，超高压电镜等,.,9,明视野显微镜,明视野显微镜（brightfieldmicroscope）是最通用的一种光学显微镜。利用光线照明，标本中各点依其光吸收的不同在明亮的背景中成像。它由物镜、目镜、聚光镜、光源、载物台和支架等部件组成。其中聚光镜用于调节显微镜的照明，物镜和目镜是放大微小物体成像的主要部件。由同轴的两个正透镜物镜和目镜组成的显微镜称为复式显微镜。,.,10,暗视野显微镜的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。暗视野显微镜虽然不具备观察物体内部的细微结构的功能,但可以分辨0.004m以上的微粒的存在和运动，比普通光学显微镜高50倍。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。,暗视野显微镜,.,11,相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。,相差显微镜,.,12,荧光显微镜(Fluorescencemicroscope)：荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。,荧光显微镜,.,13,2显微镜的构造,1.光学部分:接目镜、接物镜2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持调节固定等作用.3照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等).它使检视物放大,造成物象.,普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。,.,14,3显微镜的物镜种类,微生物学研究用的显微镜物镜通常有：低倍物镜(16mm，10)高倍物镜(4mm，40-45)油浸物镜(1.8mm，95-100),.,15,根据放大倍率分3类：低倍物镜：放大倍率1X-5X，数值孔径0.04-0.15；中倍物镜：放大倍率5x-25x，数值孔径0.15-0.6；高倍物镜：放大倍率25x-100 x，数值孔径0.60-1.40；,.,16,.,17,有效放大倍率：显微镜放大倍率的极限。分辨率：能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。,分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。,显微镜的两个重要参数,当选用的物镜分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。,.,18,油镜，即油浸物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。,4油镜的使用原理,.,19,.,20,Contrast,成像质量,Brightness,Focus,Imageofpollengrainundergoodbrightness(left)andpoorbrightness(right),Imageofpollengraininfocus(left)andoutoffocus(right),Resolution分辨力,Imageofpollengrainwithgoodresolution(left)andpoorresolution(right),Imageofpollengrainwithgoodcontrast(left)andpoorcontrast(right),.,21,油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，香柏油的折射率n1.52，而玻璃的折射率n1.52。,油镜的特点,.,22,当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了。,.,23,利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值孔径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NA=数值孔径n=介质折射率最大入射角即镜口角数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；,1、数值孔径,.,24,2、D:是指显微镜能辨别物体两点间最小距离。可见光的波长为0.4-0.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔径为0.65的物镜，则D=0.55微米/20.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=0.22微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。,.,25,3、放大率：显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即：V=V1V2,.,26,1、取镜2、调节光源3、低倍镜观察4、高倍镜观察5、油镜观察,8.1.4操作步骤,油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。,.,27,使用油镜按下列步骤操作：1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。,.,28,注意事项1.使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线。2.油镜使用完毕，移开物镜镜头，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。3.将各部分还原，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。,.,29,2细菌简单染色和革兰氏染色,2.1目的与要求掌握细菌涂片标本的制备掌握革兰氏染色法的步骤和关键点识别细菌革兰氏染色结果,.,30,菌种牛肉膏琼脂斜面28培养24h的大肠杆菌(Escherichiacoli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28培养16h的枯草杆菌(Bacillussubtilis)斜面菌种；仪器显微镜；材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；,8.2.2实验材料,.,31,8.2.3实验原理,虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。,染色的意义,.,32,简单染色法,所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。,在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystalviolet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。,.,33,革兰氏染色法,原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。,是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯克里斯蒂安革兰（HansChristianGram，1853年1938年）于1884年所发明,染色结果：革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。,.,34,载玻片准备：取一张清洁载玻片，用蜡笔在其背面画出二个有一定间隔、直径约12cm的涂抹范围，用数字或符号做好标记。涂片：将接种环在火焰上烧灼灭菌，冷却后取菌液直接涂布在标记的涂抹范围内。接种环在火焰上烧灼灭菌。干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于离酒精