课题3　血红蛋白的提取和分离 (4)

P53,P64,一、分离蛋白质的原理,P64,分离叶绿体中的色素用什么方法？,层析法也叫色谱法除了纸层析，还有柱层析（也叫凝胶色谱）,色谱法又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。,色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质随流动相运动速度各不相同，这样混合物中的不同组分在固定相上相互分离。,一、分离蛋白质的原理,二、凝胶色谱法的原理,P64,凝胶是一种理化性质稳定的惰性介质。,一、分离蛋白质的原理,二、凝胶色谱法的原理,P64,P65,一、分离蛋白质的原理,二、凝胶色谱法的原理,三、缓冲溶液的作用,P65,一、分离蛋白质的原理,二、凝胶色谱法的原理,三、缓冲溶液的作用,P65,缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。,一、分离蛋白质的原理,二、凝胶色谱法的原理,三、缓冲溶液的作用,四、电泳的原理,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度也就越快,反之则较慢。,分子越小,其迁移的速度也就越快,反之则较慢。,分子形状,决定它与介质的摩擦力，影响移动速度。,P65-66,原理,一、分离蛋白质的原理,二、凝胶色谱法的原理,三、缓冲溶液的作用,四、电泳的原理电泳的用途：,纯度检测，分子质量测定，也可分离蛋白质。,P65-66,P66,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测出未知蛋白的分子量。,五、血红蛋白的提取和分离,为什么选择血红蛋白为实验对象？为什么选择哺乳动物的红细胞？,直观观察现象,红细胞无细胞核、细胞器，杂质少,样品,P66-67,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：,1.样品处理：红细胞的洗涤,血浆,洗涤的目的？分离红细胞的方法？用什么洗涤液？洗涤成功的标志？,为什么低速短时间离心？,高速长时间离心，不容易分离红细胞与白细胞，并且红细胞容易摩擦、挤压而破裂。,防止红细胞破裂,P67,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：,1.样品处理：红细胞的洗涤,血浆,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放,溶解细胞膜,渗透吸水涨破,加速破裂,使红细胞破裂的方法和原理？,P67,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,分离方法？,高速长时间离心,甲苯,沉淀,去除甲苯,P67,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,透析的作用？什么透析液？,保持与凝胶色谱柱相同的缓冲条件,P67,血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放,1.样品处理和粗分离：红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液,透析,去除血浆杂蛋白,目的,操作要求,防止红细胞破裂,获得红细胞内容物,加速红细胞破裂,获得血红蛋白溶液,去除小分子杂质,操作方法,洗涤、离心,加水、甲苯、搅拌,离心、过滤,样品处理,粗分离,血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放,1.样品处理和粗分离：红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液,透析,去除血浆杂蛋白,目的,操作要求,防止红细胞破裂,获得红细胞内容物,加速红细胞破裂,获得血红蛋白溶液,去除小分子杂质,操作方法,洗涤、离心,加水、甲苯、搅拌,离心、过滤,样品处理,粗分离,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,3.纯化：凝胶色谱法制作,P67-68,色谱柱直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，,凝胶色谱柱的高度与分离度有关，一般不超过1m。,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,3.纯化：凝胶色谱法制作装填,P68,重要的操作步骤？,要求达到的的效果？,操作步骤,要求的效果,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,3.纯化：凝胶色谱法制作装填,可与透析同时过夜,P69,气泡会搅乱洗脱蛋白质的次序，降低分离效果。,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,3.纯化：凝胶色谱法制作装填加样洗脱,重要的操作方法？,要求达到的的效果？,P68-69,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,3.纯化：凝胶色谱法制作装填加样洗脱,操作步骤,要求,P68-69,洗脱瓶,关,关,开,开,出口：,1,3图的区别？,维持流速的恒定,维持pH的稳定和蛋白质的结构、性质,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,P68-69,洗脱瓶,开出口,调整加样渗入洗脱收集,开出口,关出口,开出口,关出口,五、血红蛋白的提取和分离,1.样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放2.粗分离：分离血红蛋白溶液,透析,3.纯化：凝胶色谱法制作装填加样洗脱,4.纯度鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,P69,P69-70,或,蒸馏水,如果装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。,P70,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,石室金匮P29,P70,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,P70,P70,哺乳动物,红细胞无细胞核、细胞器，杂质少,红细胞的洗涤,通过洗涤、离心得到完整的红细胞,使红细胞破裂,血红蛋白的释放,除去细胞碎片,分离血红蛋白溶液,大分子杂质,小分子杂质,透析,纯化：凝胶色谱法,纯度鉴定,多孔板,计量溶胀倒入,洗涤平衡,样品的加入和洗脱,围绕不稀释血红蛋白不能产生气泡,平齐,样品的加入和洗脱,围绕不稀释血红蛋白不能产生气泡,加样,样品的加入和洗脱,围绕不稀释血红蛋白不能产生气泡,渗入,样品的加入和洗脱,围绕不稀释血红蛋白不能产生气泡,渗入,样品的加入和洗脱,围绕不稀释血红蛋白不能产生气泡,加入洗脱液,样品的加入和洗脱,围绕