%94 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离ppt课件

1,小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离,2,基本概念,所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。,包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大细胞、干细胞。,3,4,免疫细胞分离方法：根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS根据细胞理化性质：1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感,5,T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）,6,B细胞表面标志,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。,7,NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。,8,流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合，通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18106细胞/h)的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%99%，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。,FACS,9,荧光激活细胞分离仪分离法,10,流式细胞分析仪,11,磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。,MACS,通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。,基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。,12,13,14,免疫磁珠法细胞分选过程,15,免疫磁珠细胞分选装置,16,全自动细胞分选系统,17,Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcellPBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在1.0770.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。,密度梯度离心法,18,不同细胞密度不同,人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090,19,不同细胞密度不同,20,用1.0770.001的分层液可将细胞分离,21,密度梯度离心法,离心后,血浆,单个核细胞（PBMC）,粒细胞,红细胞,22,实验五小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离,23,胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠鼠龄越小，胸腺体积相对越大。,小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形态，属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环驻入脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。,解剖图,24,取脾脏,实验步骤：,（一）取小鼠脾脏：小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶液中浸泡35min；取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋膜组织。,25,（二）制备单个核细胞悬液：将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管中，以1500rpm离心10min。弃去上清，加ACK至23ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min；弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min；弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。,实验步骤：,26,（三）计算细胞浓度将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数；计算细胞总数：细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）X104X稀释倍数。,实验步骤：,27,28,计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对压线细胞采用数左不数右，数上不数下的原则,29,细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。,30,红细胞计数时，如果每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池计数。正常数值范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%。白细胞计数时，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%。如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏，故应先做红细胞计数稀释液要过滤，试管、计数板均清洁干燥，以免杂质、微粒等被误认为细胞。,31,实验步骤：,（四）计算细胞活力50l细胞悬液+50l的0.2%苔盼兰溶液并混匀；显微镜下观察，如果细胞被染成蓝色，旋转显微镜微调节钮，细胞无反光，则为死亡；而细胞不被染色，晶莹透亮，旋转显微镜调节钮，细胞明显反光而且有立体感，为活细胞；计算细