《负染色技术》PPT课件.ppt

第六章负染色技术,第六章负染色技术,一、基本概念1.正染色:(positivestaining)阳性反差，利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差的方法。特征：明场,背景亮,材料深暗2.负染色:(NegativeStaining)阴性反差染色，某些高电子密度的物质去包围低电子密度的样品,在黑暗的背景上,反衬出明亮的样品形貌。特征：暗场,背景深暗,材料亮,1.优点：提高了样品的分辨率和反差高。分辨率取决于染色剂颗粒的大小，颗粒直径约D=7时，1015，最高57。常用、简易、快速、不要求高纯度的样品制备技术，且用量少不改变生物活性，即不因染色造成样品变形。,二、负染色的特点,2.缺点：负染原理不清楚，结果不稳定，规律性、重复性差。(操作时，因样品的种类、染色液浓度、pH值变化常难以掌握。)负染色技术只能观察样品表面形貌，内部结构看不清楚。,三、应用1、按研究样品分:观察和研究细菌、原生动物、生物大分子、亚细胞碎片、分离的细胞器、蛋白质晶体、病毒病原物2、按研究方向分:免疫学、细胞化学,1、密度反差原理：2、异常反差原理：,PTA染液,样品氧化镁,四、负染原理：,五、负染色样品的制备颗粒状悬浮样品1、植物病毒浸出法（浓度105个/ml）针刺法2、细胞培养物3、动物组织培养物浓缩以增加病毒的检出率,六、负染色剂1、对染色剂的要求：、高电子密度，电子散射能力强、熔点高，电子照射不升华、溶解度大，不析出沉淀、本身无结构，与样品不发生化学反应、分子小，易于渗透到不规则表面的凹陷处。,2、常用的染色剂磷钨酸类KPT，NaPT，PTA优点：适于大多数样品,颗粒细腻,反差好,图像背景干净、杂质少常用15溶液，pH6.87.4缺点：显示样品的结构细节较差，对某些病毒易产生破坏作用。,醋酸铀（醋酸双氧铀）UO2(CH2COO)22H2OpH4.05.2，0.54水溶液优点：显示病毒细节好，反差强，对样品破坏小缺点：颗粒性杂质多，当pH6.0产生沉淀而失效，见光分解,甲酸铀：0.51%水溶液，pH=4.0-5.2,不稳定，现配现用钼酸铵：13水溶液或醋酸铵溶液，pH=4.09.0反差小，性能稳定，适于有界膜的生物样品硅钨酸：12，中性偏碱下使用,1.滴染法:(悬滴法)低浓度的病毒样品可获得较好效果滴样滴染液漂洗,七、负染色方法：,2.喷雾法优点：样品在膜上分布均匀，雾滴小缺点：操作繁琐，样品用量大，混合时易产生沉淀。,3.漂浮法：沾样吸取多余液体滴染液,理想的负染色样品图象：均匀,没有边缘效应,反差良好,柔和、样品纯度：适当提纯，杂质不宜太多，特别不应有过多的糖类、样品浓度适宜：高浓度：样品堆积、重叠低浓度：寻找困难、样品分布均匀A、使用分散剂：B、亲水处理：,八、影响负染效果的因素,4、样品悬液和染液pH的问题pH6.77.25、染色的时机不干不湿，存放时间不宜太长6、用双蒸水充分漂洗7、观察时用小孔径的光阑，提高反差,番茄黑环病毒,病毒荚膜：未处理,病毒荚膜：负染色,病毒荚膜：旋转投影,病毒荚膜：金属投影,人类腺病毒在人胚肾细胞核内的晶格排列,腺病毒负染色,粘液病毒流感病毒,SARS病毒负染色,1968年，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。1975年国家病毒命名委员会正式命名了冠状病毒科。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒分为冠状病毒和环曲病毒两个属。,作业,1.名词解释：