细胞生物学教学完整ppt课件

.,第八章蛋白质分选与膜泡运输,第一节细胞内蛋白质的分选第二节细胞内膜泡运输,.,第一节细胞内蛋白质的分选,真核细胞中绝大多数蛋白质都是由核基因编码，起始合成均发生在游离核糖体上，然后或在细胞质基质中游离核糖体上完成翻译过程，或在粗面内质网膜结合核糖体上完成合成。之后蛋白质各就各位并组装成结构与功能的复合体，参与实现细胞的各种生命活动。这一过程称蛋白质分选（proteinsorting）或蛋白质寻靶（proteintargeting）。蛋白质分选主要依靠蛋白质自身信号序列，从蛋白质起始合成部位转运到其功能发挥部位的过程。一、信号假说与蛋白质分选信号二、蛋白质分选转运的基本途径与类型三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化酶体的分选,.,一、信号假说与蛋白质分选信号,细胞质的游离核糖体产生非分泌蛋白，内质网附着核糖体产生分泌蛋白。信号假说（signalhypothesis）：分泌蛋白可能携带N端短信号序列，一旦该序列从核糖体翻译合成，结合因子和蛋白结合，指导其转移到内质网膜，后续翻译过程将在内质网膜上进行。该过程需要蛋白质N端的信号肽、信号识别颗粒和内质网膜上信号识别颗粒的受体（又称停泊蛋白）等因子共同协助完成的。信号肽（signalpeptide）：信号肽位于蛋白质的N端，一般由1626个氨基酸残基组成，其中包括信号肽疏水核心区、N端和C端等3部分；原核细胞某些分泌性蛋白的N端也具有信号序列。值得注意的是，信号肽似乎没有严格的专一性。,.,信号肽的一级结构序列（图8-1）,.,信号识别颗粒（signalrecognitionparticle，SRP）：信号识别颗粒是由6种不同蛋白质和一个7S小RNA分子构成的RNP颗粒。SRP含有2种结构域，即信号肽识别结构域和核糖体结合结构域，其中信号肽识别结构域中的p54蛋白是一种包含成簇Met残基的GTP酶，Met侧链与信号肽的疏水核心结合；当SRP与信号肽结合后，核糖体结合结构域中的p9和p14蛋白复合体阻断新生肽链的翻译。SRP通常存在于细胞质基质中，等待信号肽从多核糖体上延伸暴露出来，SRP既可与新生信号肽序列和核糖体大亚基结合，又可与内质网膜上SRP受体结合，指导新生多肽及核糖体和mRNA附着到内质网膜上。信号识别颗粒的受体（又称停泊蛋白，dockingprotein，DP）：DP是内质网膜的整合蛋白，由和亚基组成，可特异地与SRP结合。亚基可结合GTP。信号肽酶（signalpeptidase）：内质网腔面上蛋白水解酶，负责切除并快速降解新生多肽的N端信号肽序列。,.,信号识别颗粒（SRP）的结构示意图（图8-2）,.,在非细胞系统中蛋白质的翻译过程与SRP、DP和微粒体的关系（表8-1）,.,分泌性蛋白的合成与跨越内质网膜的共翻译转运图解（图8-3）,共翻译转运（cotranslationaltranslocation）：分泌蛋白向rER腔内的转运是同蛋白质翻译过程偶联进行的，这种蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程称为共翻译转运。,.,膜蛋白的共翻译转运机理,膜蛋白的共翻译转运涉及几个问题：（1）靠疏水区滞留在内质网膜上；（2）单次跨膜和多次跨膜；（3）跨膜段的定向。开始转移序列（starttransfersequence）：位于新生肽链N端的信号序列（信号肽）（最终不保留），既可被SRP识别，又可引导新生肽链开始穿膜转移。内部信号锚定序列（internalsignal-anchorsequence,SA）：位于新生肽链内部的疏水序列，既是信号序列，又是肽链跨膜锚定在脂双层中的序列。内部停止转移锚定序列（internalstop-transferanchorsequence,STA）：位于新生肽链内部的疏水序列，既是肽段终止转移，又是肽链跨膜锚定在脂双层中的序列。多次跨膜蛋白：含有多个SA和多个STA的肽链将成为多次跨膜蛋白。跨内质网膜肽段的取向：一般而言，带正电荷氨基酸残基多的一端，或带正电荷氨基酸残基多的一侧，朝向细胞质基质一侧（外侧）。,.,内质网膜整合蛋白的拓扑学类型（图8-4）,STA：内部停止转移锚定序列SA：内部信号锚定序列,.,线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的蛋白质的信号序列特称为导肽（leaderpeptide），其基本的特征是蛋白质在细胞质基质中的游离核糖体上合成以后再转移到这些细胞器中，因此称这种翻译后再转运的方式为翻译后转运（post-translationaltranslocation）。这种转运方式在蛋白质跨膜过程中不仅需要消耗ATP使多肽去折叠，而且还需要跨膜后由分子伴侣帮助蛋白质再正确折叠形成有功能的蛋白。继信号假说提出与确证后，人们又发现一系列蛋白质分选信号序列，统称信号序列（signalsequence），而且有些信号序列还可形成三维结构的信号斑（signalpatch），指导蛋白的靶向转运和定位。,.,指导蛋白质从细胞基质转运到细胞器的靶向序列的主要特征（表8-2）,.,二、蛋白质分选转运的基本途径与类型,核基因编码的蛋白质的分选大体可分2条途径：（1）共翻译转运（cotranslationaltranslocation）途径：即蛋白质合成在游离核糖体上起始之后，由信号肽和与之结合的SRP引导转移至糙面内质网，然后新生肽边合成边转入糙面内质网腔或定位在ER膜上，经转运膜泡运到高尔基体加工包装再分选至溶酶体、细胞质膜或分泌到细胞外。这种蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程称为共翻译转运。（2）翻译后转运（post-translationaltranslocation）途径：即蛋白质在细胞质基质游离核糖体上合成以后，再转移到膜围绕的细胞器，如细胞核、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体，或者成为细胞质基质的可溶性驻留蛋白和骨架蛋白。,.,真核细胞蛋白质分选的主要途径与类型（图8-5）,左：共翻译转运右：翻译后转运,.,根据蛋白质分选的机制或转运方式不同，又可将蛋白质转运分为4类：（1）跨膜转运（transmembranetransport）：指共翻译转运途径中蛋白质边合成边转运进入内质网腔或插入内质网膜；另指翻译后转运途径中蛋白质在合成后依不同机制转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器。（2）膜泡运输（vesiculartransport）：蛋白质被不同类型的转运膜泡从糙面内质网合成部位转运至高尔基体进而再分选转移至细胞的不同部位，其中涉及供体膜出芽形成不同的转运膜泡、膜泡运输和转运膜泡与靶膜的融合等过程。（3）选择性门控转运（gatedtransport）：在游离核糖体上合成的蛋白质通过核孔复合体在核-质间双向选择性地完成核输入或核输出。（4）细胞质基质中蛋白质的转运：蛋白质在细胞质基质中的转运显然与细胞骨架系统密切相关，其它不明。,.,.,三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化酶体的分选,转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器的蛋白质分选是一个多步过程，需要多个不同的靶向序列（targetingsequence）。定位到叶绿体的前体蛋白N端具有4050个氨基酸组成的转运肽（transitpeptide），用以指引多肽定位到叶绿体并进一步穿过叶绿体被膜进入基质或类囊体中。转运到线粒体和过氧化物酶体的蛋白质靠的是线粒体蛋白N端的导肽（leaderpeptide）或过氧化物酶体蛋白C端的靶向序列（targetingsequence）。注意：蛋白质最终的定位还需要其它空间定位信号；蛋白质必须在分子伴侣的帮助下解折叠或维持非折叠状态，以利于通过膜；蛋白质输入通常需要能量。,.,（一）蛋白质从细胞质基质输入到线粒体,1.线粒体蛋白从细胞质基质输入到线粒体基质：两性的N端靶向信号序列（形成螺旋构象）对于指导蛋白质输入线粒体基质是至关重要的；需要分子伴侣胞质蛋白Hsc70和线粒体基质蛋白Hsc70协助；需要从内外膜接触点的Tom（外膜移位子）和Tim（内膜移位子）处输入。2.线粒体蛋白以3种途径从细胞质基质输入到线粒体内膜：途径A：具有N端基质靶向序列和内部停止转移序列；途径B：具有N端基质靶向序列和内部疏水的Oxa1靶向序列（内膜蛋白Oxa1所识别）；途径C：没有N端基质靶向序列，含有多个内部靶向序列；倆种膜间隙蛋白（Tim9/10）为外膜与内膜之间转运的分子伴侣。3.线粒体蛋白质从细胞质基质输入到线粒体膜间隙：途径A：具有N端基质靶向序列和内部间隙靶向序列（其过程类似内膜蛋白途径A，需要内膜上蛋白酶于膜间隙一侧切割释放。）；途径B：通过外膜Tom40孔直接进入膜间隙。,.,通过后翻译转运途径对核基因编码的线粒体蛋白的转运（图8-6）,A：线粒体蛋白从细胞质基质输入到线粒体基质B：线粒体蛋白通过3种途径从细胞质基质输入到线粒体内膜C：线粒体蛋白通过2种途径从细胞质基质输入到线粒体膜间隙,.,（二）叶绿体基质蛋白与类囊体蛋白的靶向输入,进入基质与线粒体的相似：叶绿体前体蛋白具有N端叶绿体（基质）靶向序列和类囊体靶向序列，进入基质与线粒体的相似：如前体蛋白非折叠，依赖于基质Hsc70水解ATP提供能量。但与线粒体不同的是：不产生跨内膜的电化学梯度。进入基质后不同蛋白的转运途径不同：一个是叶绿体SRP依赖途径（与蛋白质进入内质网过程相似）；另一种是pH依赖途径（蛋白质与其辅因子结合，在类囊体靶向序列N端的2个Arg残基和跨线粒体内膜的pH梯度是折叠蛋白输入到类囊体腔所必需的。）。,.,通过翻译后转运途径将叶绿体蛋白从细胞质基质输入到类囊体腔（图8-7）,Toc：外膜转运体复合物Tic：内膜转运体复合物,.,（三）过氧化物酶体蛋白的分选,过氧化物酶体是真核细胞中唯一利用分子氧氧化底物形成小分子用于合成途径的细胞器。由内质网出芽衍生出前体膜泡，然后过氧化物酶体的膜蛋白掺入，形成过氧化物酶体雏形。过氧化物酶体靶向信号（PTS）：常见的C端PTS1（Ser-Lys-Leu）和少见的N端PTS2（Arg/Lys-Leu/Ile-5X-His/Gln-Leu）。可溶性细胞质受体识别并结合具有PTS序列的基质蛋白将其靶向运输到过氧化物酶体的基质中。可溶性细胞质受体（Pex5或Pex7）和膜结合受体（Pex14）似乎与SRP和SRP受体的功能有相似性。需要ATP水解提供能量。可参考图7-19及相关内容。,.,过氧化物酶体靶向序列1（PTS1）指导的过氧化物酶体基质蛋白的输入（图8-8）,.,第二节细胞内膜泡运输,一、膜泡运输概观二、COP包被膜泡的装配与运输三、COP包被膜泡的装配与运输四、网格蛋白接头蛋白包被膜泡的装配与运输五、转运膜泡与靶膜的锚定和融合六、细胞结构体系的组装,.,一、膜泡运输概观,在细胞分泌与胞吞过程中，以膜泡运输方式介导的蛋白质分选途径形成细胞内复杂的膜流。这种膜流具有高度组织性、方向性并维持动态平衡。在细胞的膜泡运输中，糙面内质网相当于重要的物质生产车间和供应站，而高尔基体是重要的枢纽和集散中心。高尔基体聚集在微管组织中心（MTOC）附近。高尔基体不同的膜囊具有各自不同的成分，其它内膜系统的成员也一样，这是行使复杂膜泡运输功能的物质基础。受体蛋白返回原来的膜结构中有利于维持特定膜成分的相对稳定，如从受体介导的胞吞泡返回到质膜上，从高尔基体顺面膜囊返回到内质网以及从溶酶体返回到高尔基体的TGN等。很多蛋白质分子的表面可能含有多种介导转移与分选的信号。转运膜泡形成或出芽主要发生在膜的特异部位，即蛋白信号与受体结合的部位。细胞内膜泡运输需要多种转运膜泡参与，根据转运膜泡表面包被蛋白的不同，主要分3种不同类型：网格蛋白/接头蛋白包被膜泡、COP（包被蛋白）包被膜泡和COP包被膜泡，它们分别介导不同的膜泡转运途径,.,蛋白质的分泌与胞吞途径概观（图8-9）,.,在细胞合成-分泌与内吞途径中3种不同的主要膜泡运输方式（图8-10）,网格蛋白/接头蛋白包被膜泡从TGN出芽和从质膜内化形成，脱包被后与晚期胞内体融合；COP（包被蛋白）包被膜泡介导顺向运输（二去）；COP包被膜泡介导逆向运输（一来）。,.,蛋白质转运中涉及的3种包被膜泡的特征比较（表8-3）,.,二、COP包被膜泡的装配与运输,COP（包被蛋白）包被膜泡介导的细胞内顺向运输，即负责从内质网到高尔基体的物质运输。Sar1：一种调节膜泡转运的小G蛋白，有一个共价结合的疏水N端脂基团，帮助其插入ER膜，同膜结合的Sar1对包被蛋白的进一步装配起募集者作用。膜泡转运既能转运膜结合的蛋白，又能通过膜受体识别并转运可溶性蛋白，其包装特异性取决于被转运蛋白的靶向分选序列，借以区分哪些膜蛋白或可溶性蛋白将进一步包装转运，哪些将作为驻留蛋白而被排除在外，从而使膜泡包被直接选择靶向序列或分选信号。内质网被转运的膜蛋白具有双酸（Asp-X-Glu）分选信号，Sec24亚基为其受体。参见表8-3/-4和图8-11/-12,.,Sar1蛋白在Cop包被膜泡装配与去装配中作用模型（图8-11）,.,已知的指导蛋白质包装到特异性转运膜泡的分选信号（表8-4）,.,不同类型的膜泡运输（图8-12）,A：COP包被膜泡介导顺向运输和COP包被膜泡介导逆向运输B：驻留蛋白的回收C：出芽与膜泡包装,.,三、COP包被膜泡的装配与运输,COP包被膜泡介导的细胞内膜泡逆向运输（图8-12B），负责从高尔基体反面膜囊到顺面膜囊以及从高尔基体顺面管网状区到内质网的膜泡转运，包括再循环的膜脂双层、内质网驻留的可溶性蛋白和膜蛋白（如v-SNARE），是内质网回收错误分选的逃逸蛋白返回内质网的重要途径。ARF（装配反应因子）：一种调节膜泡转运的小G蛋白，有一个共价结合的疏水N端脂基团，帮助其插入ER膜，同膜结合的ARF对包被蛋白的进一步装配起募集者作用。细胞器中的蛋白质是通过2种机制保留及回收来维持的：一是转运膜泡将驻留蛋白有效排斥在外；二是对逃逸蛋白的回收机制，使其返回它们正常驻留的部位。KDEL：内质网可溶性驻留蛋白C端分选信号，其受体主要定位在TGN区、COP和COP包被膜泡的膜上；KKXX：内质网膜蛋白C端分选信号，其受体是COP和亚基。,.,四、网格蛋白接头蛋白包被膜泡的装配与运输,网格蛋白/接头蛋白包被膜泡介导蛋白质从高尔基体TGN向胞内体、溶酶体、分泌泡和植物细胞液泡的运输，也参与质膜受体介导的胞吞作用中从细胞表面运往胞内体转而到溶酶体的运输。TGN：既是细胞分泌途径中物质转运的主要分选位点，又是网格蛋白包被膜泡的组装位点。网格蛋白呈三腿结构，也有自组装形成多角型网格的特性。接头蛋白（AP）复合物（异四聚体）一方面将网格蛋白网格包被连接到膜上（AP的一个亚基与网格蛋白重链远端的球形结构域特异性结合），另一方面又能特异地促使一些膜结合蛋白（v-SNARE）富集到形成包被的膜区，并与之特异性结合，决定哪些蛋白将被包装转运或哪些蛋白将被排除在外，这种特异性是由转运蛋白的分选信号决定的。ARF也参与网格蛋白/接头蛋白包被的起始装配。发动蛋白（dynamin）具有GTPase活性，介导网格蛋白/接头蛋白包被膜泡的缢缩并与供体膜断裂，这很关键。,.,网格蛋白（A）、多角形网格包被结构（B）及发动蛋白介导的网格蛋白/接头蛋白包被膜泡的形成（C）示意图（图8-13）,.,五、转运膜泡与靶膜的锚定和融合,膜泡运输的关键步骤至少包括如下过程：供体膜的出芽、装配和断裂，形成不同包被转运膜泡（已学过）；在细胞内由马达蛋白驱动、以微管为轨道的膜泡运输（以后学）；转运膜泡与特定靶膜的锚定和融合（现在学）。膜泡锚定与融合是一个耗能的特异性过程：其特异性是通过供体膜和靶膜上的蛋白相互作用完成的。小G蛋白Rab主要介导供体膜和靶膜的锚定：Rab-GTP与特定转运膜泡的表面蛋白相互作用，并通过类异戊二烯基团插入转运膜泡内。一旦Rab-GTP被结合在膜泡表面，便与靶膜上的Rab效应器结合蛋白相互作用，从而使转运膜泡被锚定在适当的靶膜上。v-SNARE与t-SNARE蛋白的配对（互补性）是介导转运膜泡与靶膜融合的主要机制：NSF（N-ethylmaleimide-sensitivefactor）即N-乙基马来酰亚胺敏感因子和SNAP（solubleNSFattachmentprotein）即可溶性NSF结合蛋白负责介导不同类型膜泡的融合，但没有明显的特异性；SNARE（SNAPreceptor）即SNAP受体（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子结合蛋白受体），位于细胞器和膜泡膜上的跨膜蛋白大家族，介导膜泡与靶细胞器膜的特异性融合。其中v-SNARE位于膜泡的膜上，与之互补配对的t-SNARE位于靶细胞器膜上。,.,在供体膜和靶膜之间膜泡的锚定与融合模式图解（图8-14）,如果说Rab蛋白主要是控制转运膜泡与适当靶膜的锚定，那么，介导转运膜泡与靶膜融合的主要机制是v-SNARE/t-SNARE蛋白的配对。,.,六、细胞结构体系的组装,细胞结构体系的组装和去组装是整体上认识细胞生命活动应该关注的重要问题。生物大分子的组装方式大体可分为自我装配（self-assembly）、协助装配（aided-assembly）和直接装配（direct-assembly）以及更为复杂的细胞结构及结构体系之间的组装。有些装配过程需ATP或GTP提供能量。各类型的装配具有以下生物学意义：（1）减少和校正蛋白质合成中出现的错误；（2）可大大减少所需的遗传物质信息量；（3）通过装配与去装配更容易调节与控制多种生物学过程。事实上细胞内许多代谢活动往往涉及蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与磷脂等组装成特定的复合体，这些复合