PCR技术与应用共59页

.,参考书,美CW迪芬巴赫GS德弗克斯勒,本书由美国冷泉港实验室出版社组织国际权威实验室的专家共同研讨并撰稿，是对其10年前广受赞誉的第一版的全新修订。全书共8篇，分别介绍了PCR方法基本原理，样品制备，引物设计，PCR产物的检测，PCR介导的克隆，PCR法制备突变体，以及利用PCR进行基因的差异表达分析，RNA样品的PCR方法等。70元,.,背景,由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。,.,年，在公司工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段的简单方法，即。在年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。年，KaryMullis因此获得诺贝尔化学奖。,.,PCR只是一个简单的不起眼玩艺凯利穆利斯（KaryMullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。它最大的特点就是能不断推出新形式。PaulRabinow,.,PCR技术,聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。,在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸（dNTP）存在的条件下，由耐热DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）在体外反复酶促合成双链DNA的反应称为聚合酶链式反应。,.,#PCR反应五要素：,模板DNA：50-200ng，高纯度，增加反应特异性PCR用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。约20bp左右；含量在40-70之间；内部不能有回文序列；端不能互补。PCR用DNA聚合酶：嗜热杆菌、耐热95PCR用Buffer：Mg2+是辅基（2.0mM）。浓度太低酶活力降低；太高反应特异性降低。dNTP：100M200M,.,反应Buffer,pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂,Mg2浓度,过高非特异性严重过低无扩增产物,dNTPMixture,浓度适当避免反复冻融,*反应体系对PCR扩增的影响,.,#反应分为三步：,DNA模板变性(denaturing)在93-95之间使模板充分变性,单链DNA模板与引物退火(annealling)55左右，此温度选择根据模板和引物配对结合强弱而定，是反应特异性的决定因素,引物延伸(extension)70-72左右，为Taq酶最适反应温度。,.,#PCR原理：,.,*30次循环后靶序列扩增的数量,No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesof122438416532664201,048,576301,073,741,824,1cycle=2Amplicon,2cycle=4Amplicon,3cycle=8Amplicon,4cycle=16Amplicon,5cycle=32Amplicon,6cycle=64Amplicon,7cycle=128Amplicon,8cycle=256Amplicon,.,#PCR实验方法,1.向无菌的200或500lEppendorf管中依次加入以下溶液,反应物体积10buffer2.5ldNTP(1mM)2.5lMgCl2(25mM)2.5l引物2l模板(20ng)4lTaq酶(1U/ul)1l无菌水10.5l总体积25l,.,2.反应体系混匀，离心3.在PCR仪上设定以下程序：4.取20l反应液加4lLoadingbuffer在1.2琼脂糖凝胶上90-120V，电泳30-50min。5.在凝胶自动成像系统上观察记录实验结果,94预变性3-5min94变性30s55退火30s30个循环72延伸1min72延伸10min,.,.,.,#PCR的种类,逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）反向PCR（inversePCR）嵌套式PCR（nestingPCR）原位PCR（insituPCR）荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）多重PCR（multiplexPCR）实时PCR（Real-timePCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）不对称PCR（asymmertricPCR）锚定PCR（anchoredPCR）长片段PCR（longfragmentPCR）,.,逆转录酶,DNA聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,RT-PCR,.,反向PCR-cDNA5-端的快速扩增/5-RACE,.,.,5RACE的实验方法-PSPtetRNA的5末端,体外转录PSPtetRNA。配制PSPtetRNA和人总RNA的混合样品。设计合成5条引物。使用5RACE法获取PSPtetRNA的5末端。切胶回收目的DNA片段。进行DNA测序确认序列结果。,.,PSPtetRNA体外转录,.,PSPtetRNA的电泳结果,.,RNAMixture的配制,将PSPtetRNA与人总RNA按1：105的比例混合，此混合物用于5RACE实验。,.,人总RNA的电泳结果,.,PSPtetRNA的5端序列,AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT,.,五条引物与PSPtetRNA的位置关系图,未知序列,5,3,.,5条引物的详细序列,RTPrimer：5-(p)AAAATGACCCAG-3F1Primer：5-GTCCTGTGGATCCTCTACGC-3R1Primer：5-AGCCACTATCGACTACGCGAT-3F2Primer：5-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG-3R2Primer：5-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA-3,.,Step1.反转录反应,RNAMixture10RTBufferRNaseInhibitor(40U/ml)AMVReverseTranscriptaseXL(5U/ml)5磷标记反转录引物(200pmol/ml)RNaseFreedH2Oupto,3010分钟5030分钟802分钟4保存,1.反应液组成:,2.反应条件:,3.0mg1.5ml0.5ml1.0ml1.0ml15ml,.,Step2.HybridRNA的分解,1stStrandcDNA反应液5HybridRNADegenerationBufferRNaseH(60U/ml)dH2Oupto,30;1小时乙醇沉淀,1.反应液组成:,2.反应条件:,15ml15ml1ml75ml,.,Step3.单链cDNA的自身连接反应,Step2的cDNA沉淀物5RNA(ssDNA)LigationBufferdH2O40%PEG#6000T4RNALigase(40U/ml),16;过夜反应,1.反应液组成:,2.反应条件:,8ml12ml20ml1ml,.,Step4.PCR反应(1stPCR),Step3的连接反应液10LAPCRBufferIIdNTPMixture(2.5mMeach)PrimerF1(20mM)PrimerR1(20mM)TaKaRaLATaq(5U/ml)dH2Oupto,1.反应液组成:,2.反应条件如下:,1.0ml5.0ml8.0ml0.5ml0.5ml0.5ml50ml,943min9430sec5530sec7230sec,25Cycles,.,Step4.PCR反应(2ndPCR),1stPCR反应液10LAPCRBufferIIdNTPMixture(2.5mMeach)PrimerF2(20mM)PrimerR2(20mM)TaKaRaLATaq(5U/ml)dH2Oupto,1.反应液组成:,2.反应条件如下:,1.0ml5.0ml8.0ml0.5ml0.5ml0.5ml50ml,9430sec5530sec7230sec,30Cycles,.,2ndPCR反应结果,.,切胶回收电泳结果如下,Step5.目的DNA片段的切胶回收,.,Step6.DNA片段的序列测定,.,未知序列,5,3,测序结果与五条引物间的关系,.,PSPtetRNA的5端序列,AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT,.,差异显示PCR,又名mRNA差异显示PCR（mRNAdifferentialdisplayPCR，DD-PCR）又名差异显示反转录PCR（differentialdisplayreversetranscriptionPCR，DDRT-PCR）,.,某组织总mRNA12种3锚定引物（T12MA、T12MG、T12MC、T12MT）反转录酶12种cDNA第一链2426种5十聚随机引物分别与第一链进行PCR反应(288312次)Taq聚合酶cDNA双链可获得哺乳动物细胞内所有cDNA的片段,M=G、C、A,.,.,（荧光）定量PCR,概念：以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量。分类：分为三大类，即外标方法、动力学方法、内标共扩增方法。,.,外标法定量PCR：,.,原理Taq酶：用于荧光定量PCR的Taq酶不仅具有DNA聚合酶活性（延伸DNA引物），而且具有53核酸外切酶活性，可以在延伸过程中实现链替换，并将被替换的单链切断。,外标法TaqMan实时荧光定量PCR：,.,5端标记信号基团或报告基团(Reporter,R)，单独存在时可以发光(FAM、VIC)3端标记荧光抑制基团（Quencher，Q），Q基团对R基团有抑制作用，存在时可抑制R基因的功能，不产生发光现象当溶液中有PCR产物时，该探针可与模板的特异序列结合，结合位点在两条引物之间当Taq酶靠近探针时，激活了Taq酶的外切酶活性，将探针5的R切下，R基团发出荧光根据荧光强度计算初始模板的数量（同步指数增长）,原理荧光标记的基因探针：,.,信号基因R,抑制基因,.,.,Rn值是表示在各个反应循环数仪器所检测的荧光信号值,.,PCR高灵敏性,光谱技术高精确性,高灵敏性高特异性高精确性,DNA杂交高特异性,特点：,.,致突变PCR,M.Smith加拿大生物化学家发现“定点突变”源头创新、革命性、突破性。对基因学、基因组学及蛋白组学的研究具有巨大影响1993年诺贝尔化学奖,.,随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，改变原有序列的特征。,定向性、可选择性、无(少)干扰性、可靠性、高效率、简易性、可重复性,特点：,定义：,.,.,原位PCR,Hasse等于1990年建立。是指在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水平和细胞水平研究并重。,.,.,组织处理有何要求：处理后的标本，既要保持组织，细胞的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要充分暴露拟扩增的目的DNA或RNA，使引物、探针能有效进入胞浆中发生反应。,.,原位PCR的实验过程：实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或