《核酸分离纯化技术》PPT课件.ppt

基因诊断技术,基因诊断(genediagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析基因的存在、鉴定疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变，以诊断各种感染性疾病和遗传性疾病，进行肿瘤分子水平的研究。主要技术及过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,基因探针的制备和标记,基因诊断的特点:高度的特异性高度的灵敏性实现早期快速诊断被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因。,基本技术：（一）核酸分子杂交（二）聚合酶链反应（PCR）（三）单链构象多态性检测（四）限制酶酶谱分析（五）DNA序列测定（六）DNA芯片技术,第一节核酸的分离与纯化,意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障,原则：保证一级结构的完整性排除其它大分子的污染,要求：1.不能存在对核酸结构功能有影响的物质2.降低蛋白、多糖、脂类分子污染,一、首先了解核酸的存在状态及分布：,形状：真核生物染色体DNA是双链线状，其细胞器DNA以及原核生物DNA，质粒DNA等都是双链环状。,多数生物体的RNA分子是单链线状。而且，不同类型的RNA还有不同的结构特点。如真核生物mRNA多数有PolyA尾巴。至于病毒、类病毒所含的DNA和RNA分子则形式多样，有双链线状、双链环状、单链线状、单链环状等。无论DNA还是RNA，在体内都形成一定的高级结构。,分布：真核生物的DNA主要存在于细胞核中，只有约5%在线粒体、叶绿体等细胞器中。RNA则75%左右存在于细胞质中，约15%在细胞器中，约10%在核中。原核生物DNA集中在核质区，RNA分散在细胞质里。细胞质各种RNA中，以rRNA的数量最多（约占5%），tRNA其次（15-20%），mRNA最少（1-5%）。,油菜叶片总RNA的非变性电泳（A）和甲醛变性电泳（B）结果,二分离纯化核酸时的注意事项,要得到具有生物活性的核酸大分子，在分离时必须避免核酸变性，并尽可能保持分子的完整性，避免降解。因此，要注意下列事项：.尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少变性降解的机会。,.减少化学因素对核酸的降解,，避免酸碱对核酸的磷酸二脂键的破坏,3,5-磷酸二酯键,温度：最适温度防止机械剪切力的作用：基因组DNA：分子细长，容易受到机械剪切力的作用而断裂，所以机械剪切作用是分离DNA时的主要危险。,.减少物理因素对核酸的降解,操作时动作必须轻缓，搅拌时要温和，避免让DNA溶液通过狭窄的孔道。在提取缓冲液中加入蔗糖或山梨糖醇等增加溶液的渗透压。提取分子量较小，结构又很紧密的DNA，如小的细菌质粒超螺旋DNA等时，机械剪切力的威胁较小，操作时可不必过于谨慎,核酸酶直接破坏核酸一级结构，必须抑制其活性对于DNA酶：大多数DNA酶作用时需要二价金属离子，如Ca2+,Mg2+等。因此只要加入EDTA（乙二胺四乙酸），螯合剂就可以基本上抑制DNA酶的活力。,.防止核酸的生物降解,无所不在的RNA酶：外源性RNA酶：RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中用到的试剂和溶液。内源性RNA酶：组织本身所固有的，在某些组织中（如胰腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。,对于RNA酶：其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的pH作用范围，抗高温严寒（065均具有活性）。而该酶作用时不需要二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。,三核酸的分离提取大致步骤：,.收集细胞,.破碎裂解细胞（或细胞器）,.解聚核蛋白并去除蛋白质,.沉淀核酸并去除其他杂质（纯化）。,（一）破碎细胞,1机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法，称为机械破碎法。,2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。常用的物理破碎方法有：温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热胀冷缩的作用而破碎。该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到预期的效果。,压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声空穴局部过热引起的生物大分子的变性，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。,.化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton，Tween等表面活性剂。.酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。,（二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除1酚抽提法酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质充分接触氯仿和苯酚而变性，与核酸分开。离心后分为两相，一般上层为含有核酸的水相，下层为有机相，相界处则是变性凝聚的蛋白质层。用有机溶剂处理核酸溶液时，既要使水溶液与有机溶剂充分接触，又要注意防止剪切力对DNA的破坏。有机溶剂处理以去除蛋白质的次数视蛋白质的含量和制剂纯度要求而定，一般要处理到中间变性蛋白质层消失为止。,2表面活性剂法破细胞时所用的SDS等阴离子去污剂除了可以溶解膜蛋白和脂肪外，还可解聚核蛋白。3蛋白酶水解法用蛋白酶水解去除蛋白质的方法比较温和，可避免剪切力的破坏。,（三）核酸的沉淀沉淀的目的：改变核酸溶解缓冲液；调整核酸浓度；去除部分杂质及某些盐离子。实验室常用的核酸沉淀剂为乙醇和异丙醇。异丙醇：所用的体积小（一般为2/3体积），一般不需要在低温下长时间的放置。但异丙醇不易挥发除去。乙醇：很易挥发除去，但所需的体积大（一般为2倍体积），且需要在低温下长时间放置（如沉淀RNA时一般要-20至少放置2小时）。,沉淀核酸时，一般还要加入一定浓度的盐溶液，如NaAc或NaCl。这是因为在pH为8左右的溶液中，核酸分子是带有负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷斥力，易于互相聚合而形成核酸的盐沉淀。加入的盐溶液浓度太低：只有部分核酸形成钠盐而聚合，这样就造成核酸的沉淀不完全。加入的盐溶液浓度太高时：核酸沉淀中有较高浓度的盐的存在，会影响到下游操作，例如DNA的限制性酶切反应。此时必须要进行洗涤或重沉淀。,沉淀核酸时的温度、所需时间以及沉淀后离心的速度和时间，取决于核酸分子的大小，浓度以及有无助沉淀物存在。核酸分子越小、浓度越稀，沉淀时所需温度越低，时间也越长，离心时要求速度高、时间长。,（三）核酸的洗涤离心沉淀得到的核酸一般还要用70%的乙醇洗涤以去除盐分及一些小分子的杂质，真空抽干或室温晾干后溶于适当的溶液中。,（四）核酸的浓缩如果核酸溶液中DNA含量低，体积较大，不易进行乙醇沉淀时，可采用固体聚乙二醇吸水浓缩法或正丁醇抽提浓缩法进行浓缩。固体聚乙二醇吸水浓缩法：将待浓缩的DNA溶液装入透析袋中，在透析袋外加适量的固体聚乙二醇，使DNA脱水达到浓缩效果。正丁醇抽提浓缩法：利用部分水分子可分配于有机溶液中，使溶液的体积减少，有机溶剂则不吸取溶液中的DNA和其盐类分子。,（五）核酸制剂的保存分离提取到的核酸制品在保存过程中要防止变性和降解。因此，溶解核酸的溶液必须含有螯合剂以抑制DNA酶，溶液的pH为78，防止酸碱变性，同时该溶液要有一定的盐浓度，因为在纯水中核酸双链（或双链区）的两条链上磷酸根负离子互相排斥，使双链分开而变性，Na+等正离子可中和磷酸根的电负性，保持双链结构。现在较普遍是将DNA溶于TE溶液（10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH8.0），-20保存。而RNA则通常溶于DEPC水中。,（六）核酸制剂纯度的初步鉴定纯净的核酸制品在260nm波长处有吸收高峰，230nm为吸收低谷。,核酸的紫外吸收曲线,纯度：A260/A280：双链DNA为1.8，而RNA为2.0。含量：50A260样本稀释倍数1000双链DNAug/ul40A260样本稀释倍数1000单链DNARNAug/ul33A260样本稀释倍数1000单链寡聚核苷酸ug/ulDNA,第二节酚氯仿抽提法分离基因组DNA,酚氯仿抽提DNA的原理,去除蛋白质最经典的方法是酚氯仿抽提法，也是最常用的方法。酚氯仿抽提法的原理是：利用核酸与蛋白质对苯酚的变性作用具有的不同反应性分离核酸与蛋白质。在细胞破碎步骤后的样品混合液中用苯酚抽提和高速离心后，样品中的蛋白质成分被变性，或者变成不溶性物质，而核酸则溶解在水相中。,苯酚抽提通常采用苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液。这种混合溶液比单纯的苯酚更有效地使蛋白质变性，并且有助于稳定RNA，随后氯仿、异戊醇抽提，将残留苯酚从水相中（含核酸）除去。最后用乙醇沉淀DNA，同时也可去除残留的氯仿,试剂配制要求及作用,酚的重蒸馏和平衡酚易氧化，其氧化产物对DNA有破坏作用，使用前需要将酚进行重蒸馏。苯酚65熔化后，用空气冷凝管进行重蒸馏，183收集纯净酚。由于酚是中强酸使用前要进行酚的平衡，在纯净酚中加入等体积的1mol/lTris-HCl缓冲液(pH8.0)并加入固体Tris，激烈震荡使酚的pH值平衡到8.0。酚中常加入抗氧化作用的8-羟基喹咛，8-羟基喹咛使酚呈现黄色，可作为指示颜色。将酚保存于棕色瓶中，表面覆盖一层0.1mol/lTris-HCl(pH8.0)防止氧化。,酚氯仿异戊醇混合液配制氯仿为挥发性有机溶剂，可使蛋白质变性，加入氯仿可以:1.减少酚的用量；2.使蛋白质变性更为彻底；3.同时可抑制核酸酶的活性。异戊醇可消除抽提时有机相和水相之间产生的气泡，有利于分层。通常按酚氯仿异戊醇25241比例将三种试剂混合，要求用时临时配制。,主要所需的试剂及消耗品:,TES溶液蔗糖-TES溶液溶菌酶(50mg/ml)EDTA溶液(0.25mmol/ml)SDS溶液(10g/l)饱和酚:氯仿:异戊醇(PH8.0)NaAc（3mol/l）无水乙醇，70%的乙醇,实例：原核生物（大肠杆菌）基因组DNA的分离纯化过程1.吸取已培养好的大肠杆菌液体5.0ml于中号试管中,4000转/min离心15min，弃去上清，加入一定体积的TES液，洗菌体12次，如上述方法收集菌体，将培养细菌的一些营养物的清洗干净。2.弃去TES液后，管底菌体大约200ul，加入五倍体积的预冷蔗糖-TES液约1ml，在冰浴中充分混匀，加入溶菌酶（50mg/ml）至终浓度1mg/ml，（计算方法，50x=11,x=0.02ml）充分混匀后，在0处理15min该步骤作用为破坏细胞壁，为了防止酶的变性，需低温处理，同时加EDTA抑制DNA酶。,3.加入EDTA（0.25mol/l）至终浓度为0.1mol/l(计算为0.25X=0.1（1+X）约取0.25mol/lEDTA600700ul轻轻混匀后，0处理10min。充分抑制DNA酶的活性，再加入SDS或（蛋白酶K）溶液至终浓度为10g/l，混匀，于37裂解30min，94裂解1min。该步骤为裂解细胞膜：裂解胞膜可以用蛋白酶K，由于蛋白酶K价格较高，所以常用SDS（胞膜双脂层。SDS为十二烷基磺酸钠，为一种表面活性剂，能破坏双脂层）常配制的SDS为100g/l，加入时据体系中的总体积进行计算（100 x=101.8,x=180ul200ul）4.在37裂解后，呈现为高粘稠性半透明溶液，将试管内的裂解液分装在两个1.5mlEP管中，约0.7ml。取其中一管进行下一步试验，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提（由黄色变为乳白色），于12000转/min离心10min，将上层水相抽一入另一个EP管中，重复上述抽提一次，吸取上层水相于另一个EP管中，加入等体积的氯仿：异戊醇=24：1，抽提一次，操作同前,5.小心吸取上层水相，转移至另一个1.5mlEp管中，加入1/10倍体积的NaAc及2倍体积的无水乙醇。-20静置10min后观察沉淀（DNA）挑取出DNA沉淀加入70%的乙醇1ml洗涤一次。12000转离心2min.6.弃去乙醇，在室温下挥发干剩余乙醇，加入10mmol/l的TE溶液50ul。溶解乙醇。7.-20保存。,离心机水浴锅EP管微量移液器,仪器用具,第三节碱裂解法抽提质粒DNA,原理：在PH12.0-12.6的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环（CC）质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可将去除大部分细胞碎片染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒,主要试剂及作用：STE用于洗涤细胞。配制方法：0.1mol/LNaC110mmolLTris-C1（pH8.0）1mmol/LEDTA溶液维持溶液pH值，抑制DNA酶。配制方法：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-C1（pH8.0）10mmol/LEDTA,溶液碱变性法的主要试剂，使DNA变性，沉淀染色体DNA。配制方法：0.2mol/LNaOH1%SDS溶液起中和作用。配制方法：5mol/LKAc60ml冰醋酸15ml水28.5mlTE（pH8.0）（含无DNA酶的RNA酶20ug/ml）溶解DNA沉淀。RNA酶可以水解RNA分子。,主要操作步骤：细菌培养及菌体收集挑取琼脂培养板上的单菌落，移至2-5mlLB培养液中（含适当的抗生素）37C强烈摇荡过夜。取出1-1.5ml培养液移至eppendorf管中，12000转离心30秒钟，弃上清，用1m1STE悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体。再重复用STE，漂洗菌体，离心后，去尽上清液。收集细菌后可选择以下方法提取质粒。,（1）将细菌沉淀悬浮于100u1冰预冷的溶液I中，强烈振荡混匀s（2）加入200ul溶液，盖严管盖颠倒微型离心管5次以混合内容物，不要强烈震荡，放置冰上5分钟左右。（3）加入150u1溶液，可以将管盖朝下温和振荡10秒钟，冰水放置3分钟。（4）12000转，4C下离心5分钟，取上清移至1个新eppendorf管中。,（5）加入等体积酚氯仿振荡混匀，12000转，4C下离心2分钟，取上清移至另一管中。（6）加入2倍容积乙醇（室温），振荡混匀室温下放置2分钟（7）12000转4C离心5分钟。,（8）弃上清，加入lrn170乙醇振荡漂洗沉淀，12000转4C离心2分钟。（9）弃上清，用消毒的滤纸小条小心吸净管壁上的乙醇水珠，将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇几分钟。（10）加入20-50ulTE（pH8.0）（含无DNA酶的RNA酶20ug/ml），溶解DNA，短暂振荡5分钟后可进行内切酶酶切实验或一20C储存。,第三节真核细胞总RNA的制备,如何创造一个无RNA酶的环境（关键）无所不在的RNA酶：外源性RNA酶：RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中用到的试剂和溶液。内源性RNA酶：组织本身所固有的，在某些组织中（如胰腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。,异硫氰酸胍法分离总RNA的原理利用高浓度强变性剂异硫氰酸胍使细胞结构迅速破坏，释放出RNA分子，通过酚氯仿抽提即可得到总RNA。,材料及试剂1.无RNA酶的水的配制在三蒸水中加入0.1%DEPC，37放置1216小时，高压灭菌30分钟，去除残留的DEPC。,2.变性缓冲液使细胞结构破坏，释放RNA。4mol/L异硫氰酸胍25mmol/L柠檬酸钠0.85%十二烷基肌氨酸钠0.1mol/L巯基乙醇10%十二烷基肌氨酸钠3.2mol/LNaAc（pH4.0）为沉淀RNA提供Na。4.水饱和酚液（pH4.0）抽提RNA。,操作方法组织细胞的匀浆、变性离心收集培养的细胞，用PBS缓冲液洗涤，4000r/min离心10分钟，去除PBS缓冲液，重复3次，加入变性液振荡至细胞裂解，液体变黏稠。,RNA抽提在上述裂解液中，加入1/10倍体积的2mol/LNaAc、等体积的水饱和酚、1/5体积的氯仿异戊醇（491）（每加一种试剂后均应充分振荡混匀），置冰浴15分钟，4、12000r/min离心20分钟，小心吸出上清，注意不要吸出富含蛋白质和DNA的中间界面。再加等体积的酚及1/5体积的氯仿异戊醇（491），颠倒混匀，4、12000r/min离心20分钟，小心吸取上清。,沉淀RNA加入等体积的异丙醇，20沉淀12h。4、12000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用0.3ml变性液，重新混悬至沉淀完全溶解。加等体积异丙醇，混匀，2012h，4、12000r/min离心20分钟，弃上清，用预冷的75酒精洗涤沉淀12次，将沉淀于室温晾干，溶于无RNA酶的水中。,原理与蛋白质分子类似，DNA分子也是两性电离分子。在pH8.08.3时，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动。但不同大小和构象的DNA分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，迁移率区别很小，难以分开。采用适当浓度的