凝胶迁移实验

凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。实验步骤：探针的标记 探针的纯化 EMSA胶的配制 EMSA结合反应 电泳分析一、探针的标记1.设置探针标记的反应体系；2.使用水浴或PCR仪，37反应10分钟；3.加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。4.再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。5.标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20。二、 探针的纯化1.对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。2.在-70至-80沉淀1小时，或在-20沉淀过夜。3.在4，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。4.在4，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。5.加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20。三、EMSA 胶的配制1.准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。2.按照如下配方配制20毫升4的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。3.按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。四、EMSA结合反应1. 如下设置EMSA结合反应阴性对照反应： （1）Nuclease-Free Water ：7微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。（4）标记好的探针 ：1微升。（5）总体积 ：10微升。样品反应：（1）Nuclease-Free Water ：5微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。（4）标记好的探针： 1微升。（5）总体积： 10微升。探针冷竞争反应：（1）Nuclease-Free Water ：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。（4）未标记的探针： 1微升。（5）标记好的探针： 1微升。（6）总体积 ：10微升。突变探针的冷竞争反应：（1）Nuclease-Free Water ：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。（4）未标记的突变探针： 1微升。（5）标记好的探针： 1微升。（6）体积 ：10微升Super-shift反应：（1）Nuclease-Free Water：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。（4）目的蛋白特异抗体 ：1微升。（5）标记好的探针：1微升。（6）总体积 ：10微升。2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25)放置20分钟。 3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。五、 电泳分析 1.用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。 2.把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。3.按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。4.剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。5.干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。EMSA实验成功的关键因素：1.试验设计用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间梯度的问题,这个很关键！总结建议:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度！二是用药物刺激产生受体可能时间会长一些，因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程。时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点。2.核蛋白样品的制备（1）注意用专用的核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像；（2）掌握好核蛋白的浓度和纯度，尤其是浓度。能入核的蛋白本来就不是很多，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是比较高的! 一般要求在1ug/ul以上！有时候稍微低于这个数量级也可以，但是不能太低，否则影响结合反应拿不到结果。这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失。（3）同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好做的多，最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多。而组织抽提后杂蛋白相对较多！杂蛋白多会不容易得到EMSA阳性结果！3.探针的制备: 生物素标记到3端还是5端？其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸-标记生物素-纯化-退火合成双链.也是一个比较复杂的过程。（在操作中会用到同位素，要注意实验室环境和实验员的保护）4.EMSA实验技术要点（1）制胶 必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol（50%甘油） 1.0mldH2O（蒸馏水） 14.8mlTEMED（四甲基乙二氨） 20l脱气10min 10% AP（过硫酸氨） 120l总量 20.0ml（2）探针用量: 这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是最少50fmol.（3）蛋白样品用量: 一般用量在2-20ug(控制在1-5l)蛋白, 总体系15ul. 细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.其他的对照的含义:. 常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白标记探针)； 阴性对照反应(核蛋白标记探针); 阳性对照(核蛋白标记探针) 探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白标记探针标记探针100倍量的未标记探针)； 突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的 核蛋白标记探针标记探针100倍量的未标记突变探针)； Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白标记探针目的转录因子的特异抗体).（4）预电泳和电泳：0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时; 务必换掉预电泳的缓冲液, 用新的0.25X TB低温下150V，电泳约60分钟。注意横压电泳的时候注意电流的数字变化,记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化!（5）电转运在0.5X TBE中390mA电转移40分钟, 注意转运膜的选择, 有一种离子加强型的转运效果比较好! 我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好!（6）紫外交联: 正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的!（7）化学发光反应包括Blocking Buffer 30分钟封闭, Streptavidin-HRP标记, Washing Buffer洗涤; Equilibration Solution平衡, 这些按照规定操作即可! 没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液体中混