《微核检测技术郭》PPT课件.ppt

植物微核检测技术,哈尔滨师范大学生命科学与技术学院遗传教研室2010年3月,背景知识毒理遗传学：,或称遗传毒理学，用遗传学方法研究环境因素对遗传物质的损害及其毒理效应的遗传学分支学科，提供了许多迅速、准确、简便的方法来检测各种环境因素对遗传结构的危害，以便采取措施，减少这些因素对人类的危害。应用：评价各种化学物的安全性（药物的临床过渡），人类环境的现场监测、人群健康监测（职业病的防治）以及遗传毒性与疾病、肿瘤的流行病学调查等。,环境中可产生诱变的因素：,物理诱变：如紫外线，X-射线，-射线，快中子，激光，微波，离子束等。化学诱变：如烷化剂(包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等)，天然碱基类似物,氯化锂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等嵌入染料。空间诱变：宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空间站及航天飞机等空间飞行器进行搭载。复合诱变：两种或多种诱变剂的先后使用。,环境因素造成的遗传毒理效应：“三致效应”,突变形成：环境因素诱发生殖细胞的基因突变（点突变）和染色体畸变，从而造成子代遗传性疾病发生频率的增加，癌形成：环境因素诱发体细胞基因突变或在亲代遗传的突变形成的背景上诱发体细胞突变，引起的体细胞恶性转化为癌细胞的作用；致畸效应：环境因素作用于发育中的胚胎细胞干扰了基因的正常作用，从而影响到胚胎细胞分化和器官系统的发育而导致畸胎的发生，也包括环境因素诱发亲代生殖细胞的基因突变或染色体畸变引起畸胎的作用。,“三致效应”的检测方法：,早期的方法：用待测化学物质喂饲、注射动物或涂布在动物皮肤上，然后观查动物是否因此而患肿瘤或出现畸胎等，可检测各种化学物质的致癌和在胚胎发育过程中的致畸效应。现在一般都采用细菌、离体培养的哺乳动物和人类体细胞、植物为测试对象，主要的方法有：以基因突变为指标的检测法以染色体为指标的方法,以染色体为指标的“三致效应”的检测方法：,经典的染色体畸变分析方法；姐妹染色单体互换测试法；微核测试法。,（1）断片（2）双着丝点（3）环,遗传毒理评价所用的材料：,利用植物、昆虫（果蝇）、水生动物等生物的细胞可以现场监测水源、空气及作业环境中遗传毒物的存在。为此，发展了紫露草花序、蚕豆根尖、鱼红细胞遗传毒性试验方法以及Ames（原生动物）空气现场采样方法等。动物细胞：小鼠骨髓细胞、外周血淋巴细胞等。应用多种人类细胞：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、头皮毛囊细胞、痰液细胞等检测微核、染色体畸变、姐妹染色单体互换率等指标，对人类接触遗传毒物的剂量及效应进行评价。,微核测试法：（micronucleustest,MNT）,20世纪70年代初期由Matter和Schmid首先建立了一种简便、快速、评价客观地检测来自环境中的各种理化及生物因子对机体产生潜在的遗传损伤方法，即用哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核（polychromaticerythrocyte,PCE）出现率的实验方法。,由于大量新的化合物的合成、原子能的应用、各种工业废物的排出，需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核生物的测试结果更能直接推测反映诱变物质对人类或其他高等生物的遗传危害，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、食品添加剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。,智能全自动微核分析系统：,法国IMSTAR,本实验的目的：,通过植物根尖微核试验，学习微核的制片技术、识别及计数方法。掌握评价理化因子对机体遗传损伤的快速筛选方法。,实验原理：,微核（micronucleus,MN）是真核生物细胞中的一种异常结构。由于细胞经辐射或化学药物等作用使染色体受到损伤，在有丝分裂中、后期细胞中形成丧失着丝粒的染色体单体或染色体断片，游离于子细胞质中形成的次核。在间期细胞中，常常见到比普通细胞核小很多的一个或几个圆形结构，其直径大约相当于细胞直径的1/201/3。微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。,实验材料：,毛葱（Alliumfistulosum）根尖。,实验器材：,显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子，刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精灯，指管等。,试剂,环磷酰胺（CP）卡诺氏（Carnoys）固定液希夫（Schiffs）试剂45%醋酸1N盐酸,实验步骤：,根尖的培养,环磷酰胺处理,固定,解离,染色,压片,镜检及观察,实验材料准备,临时装片制片,实验材料准备诱变处理,毛葱沙培生根，室温下2-3天即长出0.51cm长的根；置于环磷酰胺溶液中处理24小时；从药液中取出，水洗后清水培养24小时；水洗后用Carnoys固定液固定24小时，水洗，转入70%乙醇中保存。,临时装片制片细胞学鉴定,解离：取70%乙醇中保存的根尖水洗两次，用1NHCl在60处理根尖8-10min后，水洗34次，每次5min。染色：根尖在有盖的小瓶中加入希夫（Schiff）试剂染色30min2h。压片：在干净的载玻片上切下根尖分生区，滴一滴45%醋酸，加盖玻片，用滤纸吸净多余的液体，一手压住盖玻片一角，另一手持竹针轻敲盖玻片至组织呈云雾状。将载玻片在酒精灯上轻烤，在盖玻片上覆滤纸条，用拇指垂直按压制片。镜检及观察。,结果及分析：,细胞学观察：在细胞分裂间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小在主核的1/3以下，折光率及细胞化学反应性质和主核一样。,蚕豆根尖微核照片,2.微核率计算,微核率（MCN%o）=微核数/细胞数1000%o,微核检测记录表,作业和思考题：,叙述微核形