抗体酶 核酶 极端酶PPT演示课件

第六章抗体酶核酶极端酶,1,第一节抗体酶（Abzyme),抗体酶的出现使科学家设计酶的梦想正逐渐变为现实,2,问题的提出：,抗体是目前已知的最大多样性体系，机体的免疫系统可以产生108-1010个不同的抗体分子，抗体分子的多样性及其高度精确识别性使其能结合几乎任何天然的或合成的分子。能否利用抗体的这一特性将抗体开发成象酶那样的催化剂呢？1986年Science同时发表了两篇来自由Lemer和Schultz分别领导的两个研究组发现具有酶催化性质的抗体研究报告。,3,1946年,诺贝尔奖二次得主美国化学家LinusPauling提出酶催化反应的过渡态理论：酶催化化学反应的机制在于：酶能与高能、短寿命的过渡态（激发态）相结合，在这个处于反应底物和产物之间的过渡态构型中，某些键断裂而另一些键形成，从而大大降低了化学反应的活化能。,一、抗体酶的发现与研究思路酶的催化机理是降低活化能,4,5,能与过渡态结合的抗体也具有酶的性质根据Pauling理论，WilliamJencks于1969年预言：若能找到对应某反应过渡态的抗体，将其加入该反应体系中，就可观测到这个抗体对该反应的催化效应。也即：抗体若能与某化学反应的过渡态结合，则这样的抗体必也能像酶一样，使其活化能降低，从而帮助大量反应物分子跨越能障，达到加速反应的目的。这就意味着，抗体一旦能与过渡态相结合，它就具有酶的性质，即在温和条件下高效专属地催化学反应。,6,寻找过渡态类似物作为半抗原产生的抗体可能具有酶活性,由于ES过渡态中间物的半衰期很短，实践中很难获得反应的过渡态，若设计和制备稳定的过渡态类似物（能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质，它能与相应的酶紧密结合而成为该酶的竞争性抑制剂），以此替代反应的过渡态作为半抗原，诱导与其互补构像的抗体，这样产生的抗体就能识别反应过程的真正过渡态，该抗体即有酶催化反应的基本特征，可能成为一种具有酶活性的抗体。,7,如愿以偿1986年，加利福尼亚实验室的Lerner和Schultz同时报道了成功制备具有催化能力的单克隆抗体-催化抗体，证实了抗体和酶一样，能专一催化化学反应的事实。此后，抗体酶才从理论变为了现实。目前，抗体酶的研究方向是如何提高酶的效率以及免疫学中的应用。,PeterSchultz,8,Aquestion:抗体酶是酶还是抗体？,9,二、抗体酶的结构与机制什么是酶(enzyme)？酶活细胞产生，起生物化学反应催化剂作用的蛋白质。什么是抗体（antibody，Ab）？抗体是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中,能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。其本质是一类免疫球蛋白。,10,抗体结构,两条轻链(lightchain,L链)和两条重链(heavychain,H链)通过链间二硫键连接而成的四肽键结构。,11,IgG的三级结构,12,抗体酶模型,13,IgG与抗原形成的交联晶格,14,抗体与酶的异同：相同点：都是蛋白质，都有特异性。不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。,15,是酶的高效催化能力和抗体的高度选择性巧妙结的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。因此，催化抗体又称抗体酶。通过一系列化学和生物技术方法制备出具有催化活性的抗体，除了具有相应的免疫学性质，还类似于酶，具有各种催化特性。,抗体酶（Abzyme）,16,抗体酶（Abzyme）的定义抗体酶又称催化抗体（catalyticantibody），是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。,17,抗体酶的作用机制如果以激发态的分子为半抗原激发免疫系统产生抗体,那么这种抗体就可能像酶一样催化经过此过渡态的化学反应。由于在实践中很难获得反应的过渡态，激发态的过渡态分子不可能作为抗原来产生抗体，所以对某一特定的酶催化的化学反应,可以合成一种稳定态分子,它在带电性能,几何形状与反应过渡态分子结构类似。这种稳定态分子即为过渡态类似物。设计和制备稳定的过渡态类似物，以此代替反应的过渡态作为半抗原诱导产生抗体，这样产生的抗体就能识别反应过程的真正过渡态，该抗体具有酶催化反应的基本特征，可能成为一种具有酶活性的抗体。这就是我们所称的抗体酶。,18,抗体酶与天然酶相比其优势何在？（1）抗体酶可以达到专一催化某一底物转化的反应。（2）抗体酶能催化那些理论上认为非常不利的反应。（3）抗体酶能催化那些天然酶不能催化的反应。(4)不仅提供了人工生物催化剂，而且提供了研究生物催化过程的新途径。抗体的种类非常多，免疫系统可以拥有上亿种抗原特异性不同的抗体分子。应用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，有望能制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病和催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。,19,Aquestion:如何让抗体具有酶活性？,20,抗体酶制备的基本原理按照现代酶学理论，酶首先要和底物结合，使底物向过渡态转化，然后再在催化基团的作用下促进底物进行反应。免疫反应和酶反应十分相似，抗体也能专一地、高亲和力地与抗原物质结合，然后再促使抗原发生各种变化。如果能适当地改变抗体中与抗原结合部位的微环境，并在适当部位引入相应的催化基团，那就有可能使抗体转变为具有催化性能的抗体酶。,三、抗体酶的制备,21,抗体酶的制备方法,22,1.诱导法采用过渡态的底物类似物诱导作为酶的抑制剂的过渡态类似物是稳定的，因此利用抗体能与抗原特异结合的原理，可用过渡态的类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异的识别反应过程中真正的过渡态分子！首先设计和制备过渡态的底物类似物，以它作为半抗原(hapten)，再和载体蛋白质一起免疫动物，然后分出脾细胞，进而和骨髓瘤细胞融合，选出对半抗原有高亲和力的克隆，使之在培养介质中生长扩增，最后选择、纯化产生的具有催化活性的单克隆抗体。此法的关键是要设计和获得适当的过渡态底物类似物作为半抗原。,23,1.诱导法用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。,24,25,26,2.基因工程法对于已经获得的单抗，分析其氨基酸序列和相应基因的碱基序列，将抗原结合部位的基因换上编码有催化作用的氨基酸的基因，这就是基因工程法制备抗体酶的主要内容。基因工程的技术使得建立抗体基本的组合文库，并根据需要构建适当序列的基因片断已成为可能。利用抗体库技术，在将来也许有可能绕开免疫，产生完全由基因工程构建的全新抗体酶。,27,3.拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。,28,29,4.导入法在现有的抗体基础上，借助化学修饰或蛋白质工程的办法将催化基团引入到已有底物结合能力的抗体的抗原结合部位上。可以采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天然存在的催化基团引入到抗原结合部位；也可采用寡核苷酸定点诱变技术将特定的氨基酸残基引入抗原结合部位，使其获得催化功能。,30,5.化学修饰法,抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法，在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。,31,在抗体酶被发现的13年以后，他们才开始进入商业领域。目前已有一些公司，比如：美国的Med-Immune和Prolifaron公司以及以色列的AdvancedBiotechLtd.致力于抗体酶的商业应用，并且取得了一些业绩。,四、抗体酶的应用,32,1、在诊断肝炎方面的应用,利用抗体酶技术可以方便的诊断出丙型,丁型,戊型肝炎。比如对于戊型肝炎,目前已经研制出一种IgM抗体酶免检测试剂盒。此试剂盒采用间接ELISA法，检测戊型肝炎病毒IgG抗体，包被抗原为合成肽(ORF2和ORF3)，酶标抗体为辣根酶标记的单抗，试剂全部工作液化，可直接使用，包被板采用可掰板，可单人份检测，反应过程为50分钟。,33,2、在诊断胃肠道恶性肿瘤的应用,根据中华检验医学杂志的介绍，对于结直肠癌的辅助诊断和监测，常用的血清肿瘤生物学标志为癌胚抗原（CEA）、癌相关糖抗原（CA）19-9、CA72-4及CA242等。根据抗肿瘤单克隆抗体证实，血清肿瘤标志均为非特异的肿瘤相关抗原，其检测肿瘤的敏感性及特异性均有限。尝试将以上与结直肠癌有关的血清肿瘤标志进行手术前后测定及单项、双项、3项、4项联合测定并进行比较，目的在于对各肿瘤标志在结直肠癌中的应用价值进行评价，并选择较佳的血清肿瘤标志组合，以提高检测结直肠癌的敏感性。,34,3、在诊断艾滋病方面的应用,艾滋病（AIDS）是感染艾滋病病毒（HIV）后免疫功能逐渐丧失的结果。研究证明，除血液标本外，HIV感染者的尿液、唾液、泪液、精液中均可检测到抗HIV抗体。艾滋病的诊断一直以来以血清学检查阳性为基础。最近，一种新的艾滋病诊断试剂尿液HIV1抗体酶联免疫诊断试剂已经进入市场。,35,用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。,4.戒毒:,36,5.肿瘤治疗抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。,37,6、在诊断妊娠反应方面的应用,单克隆抗体酶标绒毛膜促性腺激素检测法是目前最先进的妊娠试验，灵敏度极高,阳性率几乎百分之百。用本法可在受精后10天左右即在停经之前就能确定诊断，而且操作简单，人人都能学会，也可以在家庭使用。,38,小结,取得了很大进展抗体酶研究已取得很大进展，建立了制备抗体酶的技术（包括免疫法.化学法.基因工程和蛋白质工程等方法），通过这些技术不仅从单克隆抗体中获得了酶催化活性，而且从多克隆抗体中也获得了酶催化活性。个别抗体酶的催化反应已接近于天然酶的水平，天然酶催化的六大化学反应，抗体酶都可以进行催化。抗体酶还可以催化天然酶不能催化的反应，在工业及医学中应用的潜力已初见端倪。,39,存在的问题尽管抗体酶的研究已取得很大进展，但还存在一些需要进一步发展的问题，如催化机制的研究。尽管像瑞士的诺华和美国的Bristol-MyerSquibb这样的跨国公司已经对于抗体酶的研究运用产生了很大的兴趣，并且已经与Dr.Lerner领导的研究小组进行了合作，共同开发抗癌药物。但目前对于抗体酶在工业方面的大部分应用还是处于实验阶段。,40,综上所述，催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也是人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂与底物的相互识别有了进一步的认识。它无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远的影响。当然，抗体酶研究和运用还是刚刚起步，很多实践和理论上的东西有待解决。在理论上：对抗体酶的催化效率的预测还刚起步在实践上：还没有找到一个普遍可行的筛选法在应用上：没有找到更过真正运用的抗体酶,41,最重要的一点是：抗体酶与天然酶相比，抗体酶的催化效率和转换数远远低于天然酶，还不能成为真正意义上的酶。但随着抗体酶研究的深入，特别是抗体酶制备技术的成熟以及抗体酶结晶学研究的不断深入，科学家有希望达到有目的地改造和构建抗体酶，使之成为真正意义上的酶！,42,第二节核酶（Ribozyme),一、核酶的概念二、核酶的种类三、核酶的应用四、核酶面临的问题五、影响核酶活性的因素,43,传统观念,酶的化学本质是蛋白质,只有蛋白质才能有催化功能,核酶,44,RNA,只有蛋白质才能有催化功能,酶蛋白质,？,生物催化功能,上世纪80年代初Cech和Altman各自独立地发现,核酶,45,核酶,RNA,DNA,多糖,氨基酸酯,进一步的研究发现，这是一种多功能的生物催化剂可以作用于,核酶的作用底物,46,核酶按其大小不同，大致可以分为两类，大分子核酶，如RNaseP、I组内含子和II组内含子；其分子大小为几百到几千个核苷酸；小分子核酶，如锤头型核酶、发卡型核酶、丁型肝炎病毒核酶等，其大小一般为35155个核苷酸。,47,具有生物催化功能的RNA。,一、核酶的概念,克隆酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶、,Ribozyme,Deoxyribozyme,48,根据核酶的催化反应不同，可以将核酶分成两大类:剪切型核酶，这类核酶催化的是自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶，主要包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及有蛋白质参与协助完成催化的RNaseP；剪接型核酶，这类核酶主要包括I组内含子和II组内含子，实现mRNA前体自我拼接，具有核酸内切酶和连接酶两种活性。,49,I型内含子剪接型核酶II型内含子锤头核酶剪切型核酶发夹核酶自体催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP异体催化,核酶的分类,50,锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图,三个双螺旋区。13个核苷酸残基保守序列。剪切反应在右上方GUX序列的3端自动发生。,51,三、核酶的应用,1.基础理论：生命起源的探索2.医药：1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV-)、抗肿瘤。2）免疫原性低，很少引起免疫反应。3.植物抗病毒,52,除了在治疗人类疾病方面的潜在应用，核酶(脱氧核酶)在防治动、植物病毒侵害以及基因组研究等分子生物学实验中也有一定的应用。例如田波院士等设计了针对马铃薯PSTVd(potatospindletuberviroid)病毒负链RNA的核酶，用