《医学微生物学》PPT课件

1,找答案？,核酸分离纯化的原则是什么？为防止核酸降解需要注意什么？核酸制备基本步骤？如何鉴定核酸浓度和纯度？核酸的保存方法有哪些？,核酸的分离和纯化,2,前言,核酸（nucleicacid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。,3,核酸的分类：DNA核内染色体DNA。核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体DNA。质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,4,主要内容,1.核酸分离与纯化的原则及要求2.核酸制备的基本步骤3.核酸的鉴定和保存4.核酸提取方法简介,5,1.核酸分离与纯化的原则及要求,1.1核酸分离与纯化的一般原则(1)保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究的最基本要求。(2)排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。,6,1.2核酸分离与纯化的要求(1)为保证核酸的完整性，（防止降解），在实验中应注意：尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种有害因素对核酸的破坏。减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。,化学因素？生物因素？物理因素？,7,防止核酸的生物降解（细胞内或外的各种核酸酶水解）。所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为04。DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；阴离子表面活性剂SDS。RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180干烤8h。,8,减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴露于低渗液、样品反复冻融等。高温，如长时间的煮沸。,9,(2)核酸纯度的要求：非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，如蛋白质、多糖和脂类分子；排除其它核酸分子的污染，如制备RNA时，DNA分子是污染物；去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂和过高浓度的金属离子。,10,2.核酸制备的基本步骤,11,2.1破碎细胞,(1)玻璃匀浆器匀浆,(2)液氮研磨法富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴；富含胶原蛋白的皮肤、肌腱；坚硬的组织如骨骼。(3)高速组织捣碎机捣碎(4)超声波处理法(5)化学处理法(SDS、吐温80等）(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）,12,2.2核酸分离，去除蛋白,核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。,（1）加入SDSSDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；（2）加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；,13,（3）酚/氯仿抽提酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。,14,(1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。,使用酚时应注意,15,2.3沉淀核酸,重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用；去除溶液中某些盐离子与杂质；改变核酸的溶解缓冲液。,DNA纯化柱,核酸提取（离心柱型）利用硅胶膜特异吸附核酸,16,2.3.1核酸的有机溶液沉淀法,当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态。钾、钠、镁、锂及铵根等阳离子形成的盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团使DNA分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂。,17,核酸沉淀的盐类及浓度,18,乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。,常用的有机沉淀剂,19,聚乙二醇（PEG）,优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。,20,精胺,精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理是：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。,21,2.3.2核酸沉淀的温度和时间,一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。但时间过长，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。3.核酸的浓度和纯度的测定3.1紫外分光光度法鉴定核酸3.2荧光光度法鉴定核酸,22,3.1紫外分光光度法鉴定核酸,3.1.1紫外分光光度法测DNA和RNA的含量前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25g/ml。,结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37g/ml；RNA为40ug/ml。,23,a分光光度计先用一定量的水校正零点。b吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加入到盛有一定体积水的石英比色杯中。c测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值d计算浓度。双链DNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数50/1000；RNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数40/1000。e分析纯度。,核酸定量仪可直接获得浓度，不用计算。,小分子杂质,核酸,蛋白质,紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤,24,A：测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280=1.8（1.71.9）OD260m/OD2302.01)OD260/OD2801.9,RNA污染。2)OD260/OD2802.0，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD2302.0，表明有小分子及盐存在。,26,3.2荧光光度法鉴定核酸,3.2.1测定核酸含量：原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。,常用的荧光染料还有:goldenview,gelred,sybrgreen,27,核酸鉴定实际常用操作程序,核酸定量仪测定浓度，OD260/OD280及OD260/OD230比值。,琼脂糖电泳，UV下观察验证纯度及判断是否降解,3.2.2荧光光度法鉴定核酸纯度原理：溴化乙锭(EB)等荧光染料示踪的核酸电泳结果。,28,(1)对DNADNA样品溶于pH8.0的TE，4或-20保存；长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNARNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70保存;可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20中长期保存;最常用无Rnase水或高压后的DEPC水溶解RNA，冻贮于-70-80。,3.3核酸的保存,TE：Tris-Cl,EDTA,29,4、核酸提取方法简单介绍,4.1基因组DNA的提取方法4.2质粒的提取和纯化4.3Trizol法提取总RNA,30,4.1基因组DNA的提取方法,4.1.1酚抽提法,以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提。,（DNA）,31,原理：在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。特点：不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。快速，简捷。,4.1.2基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）,常用的试剂盒：Qiagen,32,离心柱型基因组DNA提取步骤,33,甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致，但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA与蛋白质复合体，再以透析除去杂质玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于带钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的TE异丙醇沉淀法玻璃珠吸附法,4.1.3其他的基因组DNA提取方法,34,透析，沉淀，电泳，选择性沉淀,4.1.4DNA样品的进一步纯化,4.1.5DNA片段的回收,原则：提高回收率，去除杂质污染从琼脂糖凝胶中回收：DEAE纤维素膜插片电泳法，电泳洗脱法冷冻挤压法从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡,35,4.2质粒的提取和纯化,质粒的结构：超螺旋，半开环，线性DNA理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和抗变性能力更强所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)。选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。,36,4.2.1质粒提取原理4.2.2质粒DNA的纯化与回收,纯化CsCL-EB法聚乙二醇沉淀法柱层析法回收：与基因组DNA类似,37,4.3RNA的分离和纯化,RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定排除RNase的污染是RNA制备成功与否的关键,38,4.3.1RNA制备的条件与环境,洁净的实验室操作人员带口罩，勤换手套玻璃器皿（如匀浆器）、镊子180干烤8h或更长时间枪头、EP管0.1%DEPC水浸泡过夜，再高压；或直接购买无Rnase的枪头和EP管冰上匀浆，4离心,39,Trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性。Trizol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。,4.3.2Trizol法提取总RNA,40,Trizol法提取RNA步骤,1、每50-100mg组织加入1mlTrizol，用匀浆器匀浆处理，室温放置5min，使其充分裂解。12,000rpm离心5min，弃沉淀。2、加入氯仿200微升每管，剧烈振荡15s，室温放置2-3min。12000g,4，离心15min3、吸取上层水相(约400微升），至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。4、每使用1mlTrizol加入0.5ml异丙醇，室温10min。12000g，4，10min,弃上清，RNA沉于管底。5、加入1mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。12000g,4,5min。，尽量弃上清。6、室温晾干或真空干燥5-10min。加入20微升无Rnase水溶解RNA沉淀。,41,除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3末端带有1个长短不一的多聚核苷酸的结构，即poly（A）尾巴olig（dT）-纤维素柱层析法olig（dT）-纤维素液相结合离心法其他方法：磁珠法生物素标记的oligo（dT）结合poly（A）尾，再结合亲和素标记的磁珠,4.3.3mRNA的分离和纯化,42,找答案,DNArecombinationDNArecombinationtechniquevectorDNA重组技术中常用的工具酶？DNA重组技术的基本步骤？DNA重组子的筛选和鉴定的方法有哪些？-互补,第六章DNA重组技术,43,DNA重组（DNArecombination）不同来源的DNA，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程。,DNA,DNA,新的,DNA,+,连接组合,44,DNA重组技术（DNArecombinationtechnique）,又称分子克隆或基因工程：体外用限制性内切酶将不同来源的DNA分子进行特异地切割水解，获得目的基因或DNA片段与载体连接，从而组成特异的一个新的DNA分子，重组的DNA分子通过一定的方式导入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性繁殖，获得大量目的基因或DNA片段的过程。分子水平操作，细胞水平表达。,45,切,接,转,分,筛,46,重组DNA技术的基本步骤1.载体的选择与制备、核酸的分离分2.目的基因的获得切3.目的基因与载体的连接接4.重组DNA分子导入受体细胞转5.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆筛6.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化,47,DNA重组技术的开创人1.第一个实现DNA重组的人Berg1972年，Berg用E.coR切割SV40DNA和phageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。2.第一个取得基因工程成功的人Cohen1973年，CohenGroup将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。,DNA重组技术依赖于3大理论，3大技术准备：（一）理论上的3大发现：1.20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。2.20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。3.20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNARNAPr,破译了全部遗传密码，43。,技术上的3大发明：1“基因剪刀”限制性内切酶的发明（1）20世纪4060年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilusinffuenzae）分离纯化了Hind，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。,50,2逆转录酶1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下）(1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，13kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNAcDNA(complementoryDNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。,3载体(“交通工具车子”)基因工程技术诞生的第二个技术准备（1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子（富康）将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。,工具酶,常用的工具酶（toolenzymes）有：1.限制性核酸内切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA连接酶（DNAligase,ligase)3.逆转录酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)5.核酸酶(nuclease)6.末端转移酶(terminaltransferase)7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。,第一节常用工具酶,一限制性核酸内切酶（一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正关系）1.定义限制性内切酶（restrictionendonuclease,restrctionenzymes）：简称限制酶，识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶。具有识别和切割dsDNA的功能。所谓限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键）,54,2.分类限制酶都是从原核生物中发现的（400多种E/350M）。所有的限制酶可分成3类。（1）、类兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说型识别核切割的位点一致，但罕见）。（2）类基因工程说到的限制酶是型酶，具有此类酶的微生物限制修饰系统分别由限制酶和甲基化酶来完成。型酶分子量小，仅需Mg2作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段。,3.命名（1973年Smith原则、类酶，斜体字母表示）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写-该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写-该微生物种名前的2个字母第四个字母大写-有变种或株系的第一个字母罗马字母、-从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列如EcoR是指从大肠杆菌（Escherichiacoli）R株分离得到的第一种限制酶。,(二)限制酶的识别位点它能识别dsDNA的46bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是46bp，有6个以上的，但没有4个以下的。,回文结构：,57,识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。,58,+,BamH,+,Bst,同功异源酶：来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,59,BamH,Bgl,+,+,同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。,60,（三）限制性内切酶的活力单位和星号活力,1.酶活力单位在合适温度、pH值和离子强度等条件下，1小时内完全消化1g特异DNA底物所需的酶量，定义为一个活力单位。,2.星号活性限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加“*”表示克隆过程中需同时进行双酶切时，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系，否则可能影响酶的特异性,61,（四)注意事项,底物DNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚溶液中不能含SDS和过量的盐，EDTA的含量不能大于10mmol/L反应缓冲体系中一般可加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇，防止含巯基酶的氧化失活加入牛血清白蛋白稳定酶活性操作时应注意混匀反应体系,62,(六)甲基化酶,1.细菌的限制修饰系统限制（降解）外来DNA，并通过对自身DNA的修饰而起保护作用。,2.甲基化酶的应用,当制备克隆用双链cDNA时，外源DNA片段可用EcoR甲基化酶处理，使双链cDNA内部EcoR位点因甲基化受到保护而不被切割,二DNA连接酶：DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.（一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用（只能作用于双链DNA分子内或两个双链DNA分子间，不能将二个单链DNA分子连接。)（二）来源噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子；（2）最适pH值为7.2-7.4。（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）,64,三、分子克隆中常用的其他酶,1.逆转录酶,2.TaqDNA聚合酶（目的DNA片段3端加A，用于AT克隆）,3.T4多核苷酸激酶,4.末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶）,5.碱性磷酸酶,6.DNA聚合酶,7.Klenow片段（DNA聚合酶大片段）,一、载体（vector）的概念携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。基因工程所用的vector实际上是DNA分子，可以被插入DNA片段。,第二节常用载体,二、载体的分类,三、载体应具备的特征：,1)载体必须具有自我复制和表达的能力2)载体不能过大，以便于容纳较大的外源DNA片段3)具有合适的酶切位点4)具有两个以上的遗传选择标记，便于区别阳性和阴性克隆5)配备有与宿主相适应的调控原件，如启动子等,68,1、质粒载体,质粒载体是应用最广的载体严紧型质粒（strigentplasmid）和松弛型质粒（relaxedplasmid）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产品。松弛复制子的特点：复制不受宿主细菌复制系统的限制，当宿主蛋白质合成受到抑制（如培养中加入氯霉素时）其拷贝数猛增至0003000之多，该性质多基因工程技术十分有利。,69,1、质粒载体的原件构成,1)Ori复制起始点（origin，ori）2)抗生素抗性基因3)MCS多克隆位点,70,载体本身必须是一个复制单位即复制子，具有复制起始点。（1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。（2）使细胞繁殖后维持一定量的质粒拷贝数。（3）一般情况下，一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。（4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。（5）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产品。复制子-是一段包括复制起始位点，反式因子作用在内的DNA片段，其功能是通过复制使质粒能稳定存在宿主菌内。,1)Ori复制起始点（origin，ori）,71,2)抗生素抗性基因,72,是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段,3)MCS多克隆位点（multiplecloiningsite，MCS）,克隆载体和表达载体的元件构成,理想的克隆载体的特点,具有松弛型复制子（ori）在复制子外存在数个单一的酶切位点（多克隆位点）具有插入失活的筛选标志（抗性基因）分子量较小和较高的拷贝数,75,LacZ基因：大肠杆菌-半乳糖苷酶基因编码-肽链的DNA序列,互补：载体中的LacZ基因编码-半乳糖苷酶基因的-肽段，突变型lac-E.coli宿主可表达该酶的肽段（-肽段缺失），只有宿主和载体同时表达这两个片段形成互补时，才具有-半乳糖苷酶活性。,76,2、噬菌体载体,溶菌性周期,溶源性周期,77,gt10（插入型）结构,Cos：Coshesiveendsite可互补的粘性末端，当噬菌体侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端连结成环状分子。,(1)噬菌体载体,小分子外源DNA片段,78,(2)黏粒载体（又名柯斯质粒）,黏粒质粒：由质粒和噬菌体的cos黏性末端构建而成。,79,(3)单链噬菌体,胞内为双链，胞外为单链。复制型为双链环状DNA，可按细菌质粒使用。单链可用作测序、制备探针等。,3、穿梭载体定义：在原核生物载体的基础上进行适当的改造，构建出同时带有两种细胞（原核生物细胞和真核生物细胞）的复制起始点，并可在两种细胞中复制和存在的载体。,80,（二）逆转录病毒载体病毒基因组自身含有完整高效的调控元件病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系,最常用的穿梭载体：（一）SV40（猿猴病毒）载体用SV40DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒重组子不包装成病毒颗粒，而在细胞中复制或整合到染色体组中,81,4、人工染色体,酵母人工染色体（YAC）细菌人工染色体（BAC）噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC）哺乳动物人工染色体（MAC）,82,YAC主要调控元件,着丝粒：保证染色体细胞分裂过程中正确分配到子代细胞端粒：防止染色体被核酸外切酶降解复制起始点和限制性内切酶位点筛选标志：酵母中一般通过色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选原核序列及调控元件：包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等,83,YAC作为载体的主要特点,酵母是单细胞真核生物，培养方便酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因装载容量大，可达Mbp水平DNA片段连接到YAC载体的（两）臂上形成重组体，将重组体通过常规方法导入酵母已广泛应用于各种生物基因组计划,84,基因工程前考虑的4个问题：(1)基因工程的目的克隆扩增/表达:生产产品基因治疗(2)克隆片段的大小运载多大重量的车子。(3)受体细胞类型真核/原核/穿梭。(4)载体本身及其元件的质量不能搞成“豆腐渣工程”，要“强大阵容”。,85,第三节DNA重组与鉴定,DNA重组技术,将不同来源的DNA分子进行特异地切割获得的目的基因或DNA片段与载体连接重组的DNA分子导入相应的宿主细胞在宿主细胞中进行无性增殖,86,一、目的片段与载体连接,二、转化或转染,三、筛选重组子,重组DNA技术的基本过程,DNA连接酶酶促生化反应连接反应的最适合温度是1216度,外源目的基因装入载体的过程,即基因重组。,目的DNA片段与载体的连接的方法,1、粘端连接法2、平端连接法3、同聚体加尾连接4、人工接头连接,一、目的DNA片段与载体的连接,88,1、粘端连接法,粘性末端的DNA分子最容易相互连接，连接效率也是最高的。DNA插入片段与载体存在同源粘性末端同源粘性末端：相同一种内切酶产生的粘性末端或不同的内切酶产生的互补粘性末端。特点：得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点，原切割内切酶，重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。,产生两个问题：1、质粒分子自身环化2、用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA，连接时插入片段可以两个方向插入载体中,同一限制性酶切割DNA的粘性末端连接,90,目的基因,除了重组体以外，还有质粒分子的自身环化，重新形成完整质粒，这是基因重组中产生了假阳性。,如何提高连接的效率，防止假阳性的产生？,1连接前使用碱性磷酸酶，去除载体5端的磷酸抑制质粒的重新环化。2调节外源DNA和克隆载体的比例（插入片段摩尔数：载体摩尔数=3:1）3定向克隆，使用两个限制性内切酶,3、同聚体加尾部连接法,适用于外源DNA片段与载体均为平末端或为不匹配的粘性末端用末端转移酶使一个DNA分子3端接上多聚A,另一个DNA片段3端接上多聚T，按A-T配对原则相连DNA聚合酶填补空隙，DNA连接酶封口成重组DNA分子,2.平端连接DNA连接酶可催化相同和不同限制性内切酶切割的平端之间的连接,4、人工合成接头连接法,人为的在目的基因的两端加上酶切位点，使得限制性内切酶酶切后与载体形成相同的粘性末端,什么是转化（transformation）？将重组DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。什么是转染（transfection）?将构建的DNA重组体导入真核细胞的过程。什么是感染（infection)?重组DNA分子在体外包装成具有感染能力的噬菌体或病毒颗粒，然后导入细胞的方法为感染。,二、重组DNA分子转入宿主细胞,宿主细胞原核细胞：大肠杆菌真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞,1、重组体分子导入原核细胞,处于感受态细胞阶段的细菌才能成为转化的接受体。感受态细菌：细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收,（1）CaCl2转化：,细菌处于0度，二价阳离子存在的低渗溶液中，细菌膨胀成球形，处于感受态。此时加热在42度的热冲击下进入细胞，在培养基上生长数小时后球形细胞恢复原状并繁殖。转化效率为105106/ug,细菌,0二价阳离子Ca2+、Mg2+,42,60-90s,该过程不要摇动离心管,快速转移到冰浴中冷却2-3min,关键点：细菌必须处于生长对数期实验操作必须在低温下设立已知质粒载体的阳性对照不加任何质粒的空白感受态细菌阴性对照,（2)电击法（electroporation）：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高1091010/ug原理利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。,2、重组体导入真核细胞,（1）磷酸钙-DNA共沉淀法（2）脂质体法（3）电穿孔法（4）DEAE-葡聚糖介导转染（5）显微注射法,101,重组子的筛选和鉴定方法,（一）根据遗传性状变化1、抗药性标记2、抗药性插入失活3、互补4、标志补救（二）根据重组DNA的结构特征（分子生物学）1、直接电泳法2、限制性酶切图谱3、核酸分子杂交4、PCR扩增后电泳或测序,三、重组子的筛选和鉴定,载体上的抗药基因：抗氨苄青霉素基因抗四环素基因抗卡那霉素基因等,凡是转入了载体的细胞都获得了这种抗药性，可以在平板上生长菌落。,2根据载体抗药性插入失活选择,含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。,104,外源基因,抗Amp,抗Tet,抗Amp,抗Amp,抗Tet,抗Tet,重组DNA,空载体,不含有载体或重组DNA,3、-半乳糖苷酶系统（互补）,载体：pUC、pGEM系列载体等带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列，含有编码-半乳糖苷酶基因（LacZ基因）的调控序列和N端的编码序列（-肽段）,突变型lac-E.coli宿主可表达该酶的肽段，两者都存在时才具有活性。,在LacZ基因编码序列中插入了一个多克隆位点，当该多克隆位点有外源DNA片段插入时，该酶失活。,106,LacZ基因：载体中编码大肠杆菌-半乳糖苷酶基因-肽链的DNA序列,乳糖,半乳糖,葡萄糖,X-gal,5-溴化氯淀蓝,半乳糖,深蓝色,-半乳糖苷酶,+,+,互补：载体中的LacZ基因编码-半乳糖苷酶基因的-肽段，突变型lac-E.coli宿主可表达该酶的肽段（-肽段缺失），只有宿主和载体同时表达这两个片段形成互补时，才具有-半乳糖苷酶活性。,IPTC,LacZ基因,-半乳糖苷酶,在涂有IPTC和X/gal培养基上呈现兰色,X-galX(发色底物)+gal(半乳糖),-半乳糖苷酶,4.标志补救筛选若载体上的基因能在宿主细胞中表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补时，可利用营养突变菌株进行筛选。,109,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,（二）根据重组DNA的结构特征（分子生物学）进行筛选1、直接电泳法利用有插入片段的重组载体比空载体分子量大。,2、限制性内切酶图谱进行分析限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳分析是否有外源DNA的插入。,3、核酸分子杂交方法进行鉴定核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组DNA的最通用方法。菌落印迹杂交（菌落原位杂交）,113,菌落印迹杂交特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,4、PCR反应进行鉴定利用引物直接扩增外源基因后电泳或用测序进行检测,115,聚合酶链反应及相关技术（PCR：PolymeraseChainReaction),定义：PolymeraseChainReactionPrimerReverseTranscriptionPCRPCR反应的原理？PCR反应体系的成分？设计PCR引物时必须遵循的原则？,116,定义：realtimePCRCT值PCR-RFLP聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR)：在体外特异复制一段已知序列的DNA片段过程，使人们能够很快地从试管中获得大量拷贝的特异核酸片段。,117,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。,118,PCR三部曲,第一步：变性,第二步：退火,第三步：延伸,119,大肠杆菌DNA酶的Klenow片段，不耐高温，90变性失活力，每次循环都有冲洗加入。延伸反应在37进行，容易发生模板和引物直接的碱基错配，PCR产物特异性差。,120,1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到一种耐热的DNA聚合酶，耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加入酶，提高了扩增片段的特异性和扩增效率。,121,微量模板DNA,引物,dNTPs,耐热多聚酶,适量缓冲液,+,高温变性,低温退火,中温延伸,30个循环,扩增特异区段的DNA,PCR技术的原理,122,PCR技术的原理,在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧核苷三磷酸,耐热的DNA聚合酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。,123,PCR的反应体系和反应条件,（一）反应体系模板DNA、引物、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）TaqDNA聚合酶、镁离子浓度、其他反应因素（二）反应条件温度、时间、循环次数,124,（一）反应体系,1、模板（1）单、双链DNA均可。（RNAcDNA）（2)纯度：模板DNA必须有较高的纯度。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。(3)浓度：模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。一般100ngDNA模板/100L。,125,2、引物（Primer）,化学合成的寡核苷酸与模板特异地结合决定产物的特异性和长度,126,引物设计原则（1）两条，位于被扩增片段两端（2）长度18-25个核苷酸为宜（3）两条引物之间的序列不能互补，以免形成引物二聚体（4）碱基组成应平衡，最好随机分布（GC含量40-60%）（5）两条引物的Tm值不能差别太大（6）5端可加入修饰成分（7）浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降（0.1-0.2mol/L）。,127,PCR引物如何稀释,离心：收到引物后，在开启离心管盖前在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时引物干粉散失。稀释步骤：（1）上、下游引物分别稀释成10M。“add36Lbufferfor100M”，加入360L灭菌纯水成10M。（2）分别吸取上、下游引物各100L到新EP管中，加入800L灭菌纯水，配成1M的引物对。建议分装：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的重复性要求较高，建议分装，避免反复冻融。,128,（3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dCTP、dGTP和dTTP，四种dNTP浓度应相等。dNTP浓度取决于扩增片段的长度，一般为20-200M/L。（商品：10mM或2.5mMdNTP）浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,129,（4）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)1.0-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,130,TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus),1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术,131,（5）镁离子浓度,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,132,（6）其他反应因素,pH：反应所需的最适pH值在7.2左右盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：牛血清白蛋白、明胶、Tween20、DTT等商品化buffer,133,（1）温度变性温度：DNA的Tm94-95退火温度：取决于引物的Tm（引物长度和GC含量决定）。低于引物Tm5左右。温度过高：降低扩增效率温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72,（二）PCR反应条件,134,（2）时间取决于扩增片段的长度，3个步骤一般均为30s-1min。第一次变性的时间应足够长（5-7min），使其彻底变性（3）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次,135,（3）循环次数主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次。,循环数,PCR扩增效率呈S型曲线，20-25个循环后便放慢，很快达到反应平台，模板初始量越多，平台出现得越早。,136,经典循环参数（500bp以内）,137,PCR技术质量控制,实验室的规范化设置试剂贮存区和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区,PCR技术的质量保证产物污染试剂污染标本间的交叉污染,138,第二节以PCR为基础的相关技术,反转录PCR巢式PCR定量PCR多重PCRPCR诱导定点突变原位PCR差异显示PCR其他扩增技术,139,一、反转录PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR）,定义：以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术，将总RNA或mRNA进行反转录反应，以生成与之互补的cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到所需的目的基因片段。RNAcDNAPCR主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等,140,反转录引物随机引物（Randomhexamerprimer):适用于长的或具有发夹结构的RNA，包括rRNA、mRNA、tRNA。Oligo(dT)引物：适用于具有Poly(A)尾的RNA。特异性下游引物(PCR时的下游引物)：必须与模板序列互补，需了解Target序列。,141,二、巢式PCR（nestedPCR）,定义：对靶基因进行二次扩增，第2次所用的模板是第一次PCR扩增的产物；第2对引物或其中1条引物的位置在第1对引物的内侧。,142,三、荧光定量PCR,DNA结合染料技术SYBRGreenI水解探针技术Taqman杂交探针技术DualProbes(FRET)分子信标技术MolecularBeacons,143,荧光定量PCR定义,荧光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又称实时PCR(real-timePCR,RT-PCR)：通过荧光信号对PCR过程中的产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量。,144,与普通PCR的区别,普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。,145,随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图,146,147,荧光域值和CT值,荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。CT值（cyclethreshold）：阈值循环数，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。也可理解为扩增曲线与荧光本底基线的交叉点处相应的反应循环数。Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性反比关系，起始拷贝数越多，Ct值越小,148,149,绝对定量（AbsoluteQuantification，AQ）病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量（RelativeQuantification，RQ）基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究,荧光定量PCR的应用,Real-timePCR方法应用,150,绝对定量与相对定量的定义,绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常所说的拷贝数。相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。校正样本可以是对照。,绝对定量“600个拷贝”,相对定量“增加10倍”,151,绝对定量通过标准品定量,绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物,152,相对定量通过内标定量,内标（EndogenousControl）通常是-actin，GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,153,四、多重PCR,MultiplePCR：是在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个靶片段,五、PCR诱导定点突变,154,六、原位（InSituPCR,IsPCR）,in-situ源于拉丁语。指在原来的，正常、自然的部位或位置。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,155,原位PCR的作用与原位杂交（ISH）相比，灵敏度提高。既往鉴定细胞内特异序列一般采用ISH,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感