工业微生物诱变育种.ppt

营养缺陷型菌株的筛选,野生型菌株（wildtypestrain）：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株营养缺陷型（auxotroph)：野生型菌株经过人工诱变或自然变异失去合成某种必需营养（氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子(生长因子)才能生长繁殖原养型（prototroph）:营养缺陷型菌株经过回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求与野生型菌株相同,营养缺陷型菌株筛选有关培养基,基本培养基（minimalmedium,MM）：仅能满足野生型菌株生长需要完全培养基（completemedium,CM）：凡可以满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基补充培养基（supplementalmedium,SM）：只能满足相应营养缺陷型菌株生长需要，是在基本培养基中加入了相应营养缺陷型菌株所不能合成的营养因子。,5.1营养缺陷型菌株的选育,营养缺陷性突变为（单一）基因突变，是产生某种营养因子的代谢途径中某个关键酶合成基因突变造成相应酶不能产生或不能发挥作用，从而造成相应营养因子不能产生诱发突变筛选1步：淘汰野生型菌株筛选2步：检出缺陷类型筛选3步：鉴别缺陷种类,5.1.1营养缺陷型的诱变,多用亚硝基胍（NTG）、UV、亚硝酸等做诱变剂；其中亚硝基胍（NTG）诱发营养缺陷型的频率极高，一般可达10；电离辐射损伤大，一般不适宜做营养缺陷型诱变剂；用完全培养基做后培养,5.1.2淘汰野生型菌株方法1：抗生素法,细菌：用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营养缺陷型细胞因为在基本培养基中不能繁殖而得以保留具体方法和步骤见P176,5.1.2淘汰野生型菌株方法1：抗生素法,酵母菌：用加有制霉菌素基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，制霉菌素抑制真菌细胞壁中甾醇合成，从而使繁殖中的细胞产生的子细胞死亡，保留营养缺陷型细胞,方法2：菌丝过滤法,真菌和放线菌等丝状菌的野生型菌株在基本培养基中产生菌丝体，而营养缺陷型菌株以孢子形式存在，不能萌发。把诱变处理后的孢子悬液用液体基本培养基培养，适温振荡培养，使野生型孢子萌发形成菌丝体，用灭菌脱脂棉、滤纸等除去菌丝体，再培养，再过滤。重复34次，最大限度地除去野生型菌株，然后再分离,方法3：高温杀菌法,对产芽孢菌，先用完全培养基对诱变后的菌株培养到产生芽孢，再用基本培养基培养一定时间，野生型芽孢萌发成营养细胞，缺陷型芽孢不能萌发，这时用80处理一定时间，野生型营养细胞被杀灭，而缺陷型芽孢因为耐热而存活。,5.1.3营养缺陷型的检出方法1：点植对照法（见图7.12),5.1.3营养缺陷型的检出方法2：影印法（见图7.13),5.1.3营养缺陷型的检出方法3：夹层法（见图7.14),5.1.3营养缺陷型的检出方法3：限量补充法P178,在基本培养基中补充微量营养缺陷型菌株所不能合成的营养物质，野生型菌株生长快、菌落大，而营养缺陷型菌株生长慢、菌落小。,5.1.4营养缺陷型的鉴定,测定营养缺陷菌株所需营养因子的种类5.1.4.1鉴定方法方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行测定方法二：在基本培养基中加入某种营养物质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。此法可同时对多个菌株进行测定,5.1.4.2缺陷型鉴定步骤,营养因子类别测定营养因子种类测定复证试验步骤1：缺陷型营养因子类别测定：用各类营养因子的代表物质的混合物：氨基酸混合物、酪素水解物或代表氨基酸类酵母浸汁，其中氨基酸、维生素、碱基都有维生素混合物，代表维生素类核酸碱基混合物，代表核苷酸类,步骤2：缺陷型营养因子种类测定,缺陷型营养因子类别确定后，再用该类营养因子的各种代表物质纯净物做试验，以确定其缺陷哪一种或几种营养因子。可以先把该类物质分成几组进行测定，逐步缩小范围，最后菌体测定到种类(P180)常用浓度：氨基酸110mg/mL;维生素类0.010.1mg/mL氨基酸和维生素分组分别见P182表7.14和表7.15,5.2营养缺陷型突变株的应用,工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物作为杂交、重组育种的遗传标记用于微生物代谢途径研究在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研究中用作标记菌株,6温度敏感突变株的筛选P184,温度敏感突变株（temperature-sensitivemutant,TS突变体）：突变株在一定温度范围内（许可温度）正常生长，其表型和野生型没有区别，但超出这一温度范围（非许可温度），则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢停止或减弱。TS突变主要是由必需基因发生突变，致使该基因在一定温度条件下无法正常表达，或其编码的酶失活，造成细胞不能正常生长。,6.1TS突变株的选育方法,6.1.1TS突变株的诱发TS突变主要由基因错义突变所致，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、UV等诱变剂。6.1.2淘汰野生型菌株/TS菌株富集培养1抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下培养一定时间，杀灭在该温度下生长的野生型菌株，再离心除去抗生素，分离2其它方法(P185)H3放射性同位素前体法,6.1.3TS突变株分离筛选,富集培养后，用完全培养基先在许可温度下培养，再用影印法、点植法等方法在许可温度和非许可温度下分别培养，对照结果即可检出TS突变体；也可同一平板先在非许可温度培养，长出野生型菌株，做好记号，再转许可温度培养，则后长出的为TS菌株。,6.2TS突变株在发酵工业中应用,6.2.1在谷氨酸发酵中的应用增加谷氨酸产量的关键在于改变菌体的细胞膜结构和功能，通过一些有效方法使谷氨酸产生菌由谷氨酸非积累型转变为积累型。Momose等以乳糖发酵杆菌NO2256为出发菌株，选育出细胞膜结构或功能缺损的TS突变株88号，通过温度来调节细胞膜透性。当在许可温度(30)下培养繁殖得到一定量菌体后，升温致非许可温度(37)培养，使细胞膜的合成、结构或功能发生障碍，结果突变株能在高浓度生物素培养基中分泌大量谷氨酸。,6.2.2TS突变株在丝氨酸发酵中的应用,P189以C1化合物为唯一碳源的微生物合成细胞组分是通过丝氨酸途径来实现的（见图7.19).要提高丝氨酸产量，关键在于阻断丝氨酸降解。日本味之素公司的Moringga筛选到TS突变株，它们在30丝氨酸降解正常，但在3840失去降解丝氨酸的能力，因而大量分泌丝氨酸6.2.3微生物单细胞蛋白（SCP）的生产P189,7抗噬菌体菌株的选育,7.1噬菌体概述噬菌体的特点烈性噬菌体及其繁殖温和性噬菌体及其繁殖-溶源化噬菌体的专一性噬菌体的变异,7.1噬菌体概述,专一性噬菌体的获得、纯化噬菌斑烈性噬菌体效价测定重层琼脂法（见P192图7.20)每mL中所含有的侵染性噬菌体粒子数称为效价，单位为U/mL,刺突tailpins,噬菌体形态（Phage,bacteriophage）,95nm,95nm,head,neck,tail（24环）,尾丝(tailfibers),65nm,烈性噬菌体繁殖-裂解途径,吸附：病毒表面的结合蛋白与细胞的受体蛋白形成专一结合。病毒有较严格的宿主专一性,侵入与脱壳：病毒粒子进入细胞并蜕去衣壳，关键是病毒核酸进入细胞。囊膜和衣壳脱去，核酸释放，病毒粒子解体,释放：病毒粒子从细胞中释放，（再去侵染周围的其它细）。裂解式：细胞破裂，病毒粒子一起释放，出现一步生长；温和式：细胞不死不破，病毒粒子逐步释放，囊膜病毒此时获得囊膜,生物合成：病毒核酸转录、复制、蛋白合成。由病毒遗传信息“指挥”，细胞执行，合成出多套病毒核酸和衣壳蛋白,装配：生物合成的多套病毒核酸和衣壳蛋白组装成很多完整的病毒粒子。依靠生物大分子间的分子作用力自动完成,繁殖-烈性噬菌体的裂解途径,噬菌斑(plaque)：在培养敏感指示菌的平板上因病毒繁殖而使一定区域的菌体裂解，出现透明的溶菌斑块,下层培养基,双层培养基,敏感菌+上层培养基,噬菌体稀释液,培养,噬菌斑,噬菌斑,敏感菌菌苔,噬菌斑数=单位试样中噬菌体数,噬菌斑照片,繁殖温和噬菌体的溶源化途径,有些噬菌体侵入细菌后，其核酸能整合到细菌染色体上,成为前噬菌体，与细菌染色体一起复制、一起传给子细胞。这类噬菌体称为温和噬菌体，这种繁殖途径称为溶源化途径；含有前噬菌体的细菌称为溶源化细菌。前噬菌体偶尔会脱离细菌染色体，自行消失，或进入裂解途径大量繁殖，裂解细菌,溶源菌的特性,细菌的溶源性具有遗传性,溶源菌对同源噬菌体具有免疫性,溶源性细菌在培养中不易被查觉,非溶源细胞,自发裂解和诱导裂解：有少数前噬菌体可自发或诱发裂解宿主细胞，进入裂解途径,溶源性细胞可获得一些新的生理特性,复愈:溶源菌,烈性噬菌体污染造成发酵工业损失严重：轻者使发酵周期延长、产量下降，重者造成倒罐温和噬菌体污染难于发觉噬菌体危害的防治：定期更换菌种、抗噬菌体菌株选育、药物防治,噬菌体的危害及其防治,7.2抗噬菌体菌株的选育程序,抗噬菌体菌株的选育程序（以专一噬菌体做选择因子）：菌株诱变处理分离在含有噬菌体的平板上挑取抗性菌落，制备斜面菌种用含有噬菌体的液体培养基摇瓶培养筛选（重复23次）分离在含有噬菌体的平板上挑取抗性菌落抗性菌株的特性试验具体过程见P195196,7.3抗噬菌体菌株的特性研究,7.3.1抗噬菌体稳定性试验：分别接种到含高浓度噬菌体的斜面培养基、种子培养基和发酵培养基中培养一定时间，再用重层琼脂法培养，看是否出现噬菌斑；还要做连续传代培养，看抗性是否稳定。7.3.2抗性菌株的