《吸光光度法学时》PPT课件

第九章,吸光光度法AbsorptionPhotometry,化学分析：常量组分(1%),Er0.1%0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器,化学分析与仪器分析方法比较,仪器分析：微量组分(105为高灵敏度;60nm。*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。,2.显色剂与显色反应,无机显色剂:SCN-Fe(SCN)2+H2O2TiOH2O22+,有机显色剂:,有机显色剂,OO型：,ON型：,吡啶偶氮间苯二酚(PAR),S型：,双硫腙,NN型：,丁二酮肟(Ni2+),邻二氮菲(Fe2+),磺基水杨酸-Fe3+,3.多元络合物与显色反应,a.三元混配络合物：Nb-5-Br-PADAP-酒石酸，V-PAR-H2O2,b.离子缔合物：AuCl4-罗丹明B主要用于萃取光度测定,c.金属离子络合剂表面活性剂体系：AuI4-CTMAB,d.杂多酸：HSA-SiW,SpectroscopyandSpectralAnalysisVol.24,No.12,pp1630-1633,December,2004,ChineseJournalofAppliedChemistryVol.20,No.9,pp833-837,Sep.2004,1.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）,pH1pHpH2,pH,9.2.2显色条件的选择,c(R),c(R),c(R),2.显色剂用量（c(M)、pH一定）,Mo(SCN)32+浅红Mo(SCN)5橙红Mo(SCN)6-浅红,Fe(SCN)n3-n,3.显色温度及显色时间,T1(),T2(),t(min),A,4.溶剂,有机溶剂:降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度影响有色络合物的溶解度和组成，提高显色反应的速率,5.显色反应的干扰及消除,测Co2(含Fe3+):(掩蔽法),(1)化学法,测Co2:(生成络合物性质不同),如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。,测Fe3:(控制pH),(2)物理法,选择适当的测定波长,1.仅络合物有吸收，溶剂作参比。如phenFe2+标准曲线2.待测液也有吸收，被测液作参比。如测汽水中的Fe3.显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4.干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.,-选择适当的参比溶液,1测定波长选择,选择原则：“吸收最大，干扰最小”,灵敏度,选择性,9.2.3测量波长和吸光度范围的选择,2测定浓度控制,控制浓度吸光度A：0.20.8,减少测量误差,9.2.4参比溶液的选择,仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射和吸收扣除干扰,试剂空白试样空白褪色空白,9.2.5标准曲线制作,理论基础：朗伯-比尔定律,标准（工作）曲线绘制方法：在、b固定的情况下，测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，作Ac图，在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从曲线上可查出被测样品的浓度。,Thelinearityrelationofscavengingeffectofhydroxylradicalwithaqueousextractionfromeleochairistoberosapeel,9.3光度分析法的误差,不过原点：,发生偏离：,1非单色光引起的偏移,复合光由l1和l2组成，对于浓度不同的溶液a和b，引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。,9.3.1对朗伯-比尔定律的偏移,非均匀介质胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯,2物理化学因素,离解、缔合、异构等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42-PAR的偶氮醌腙式,化学反应,吸光度标尺刻度不均匀,9.3.2吸光度测量的误差,dc/c=dA/A=dT/(TlnT),Er=dc/c100=dA/A100=dT/TlnT100,P326P327,浓度测量的相对误差Er与T(或A)的关系,实际工作中，应控制T在15%65,A在0.20.8之间(调c,b,)，相对误差4%,1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度解决高(低)浓度组分(A在0.20.8以外)问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、精密差示吸光度法特点：以标准溶液作参比溶液原理：A相对=A=bcx-bc0=bc准确度：读数标尺扩展,相对误差减少c0愈接近cx,准确度提高愈显著结果计算：cx=c0+c,9.4常用的吸光光度法,例：用普通分光光度法测得标液C1的透光率为20%，试液的透光率为12%，若以示差法测定，以C1为参比，则试液的透光率为A.40%B.50%C.60%D.70%,答案：C.60%,1.单一组分测定,1)金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂,2)磷的测定:DNA中含P9.2%,RNA中含P9.5%,可得核酸量.,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O,磷钼黄(小),磷钼(V)蓝(大),9.5吸光光度法的应用,3)蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)氨基酸测定茚三酮(紫色化合物)5)水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6)药物含量测定比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7)紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。,2.多组分的测定,xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液在1,2处分别测得,在1处测组分x,在2处测组分y,b)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y,c)x,y组分不能直接测定A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1处测得A1)A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2处测得A2),3.测定弱酸和弱碱的离解常数,AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以HB或B-形式存在。,HBH+B-,pKa=pH+lg,HB,B-,A=AHB+AB-,对pH作图即可求得pKa,P133(5-30)：,4.络合物组成确定,饱和法（摩尔比法）,制备一系列含钌3.010-5mol/L(固定不变)和不同浓度（小于12.010-5mol/L）的PDT溶液，按实验条件，485nm测定吸光度,作图。,PDT:Ru=2:1,等摩尔连续变化法,固定M+L,改变M,获得一系列吸光度值，吸光度最大的值所对应的M与L的比值，即获得M:L比值。,Co(III)与3，5二氯PADAT的比值为1:2,平衡移动法,固定M,不断改变L，以lgMLn/M为纵坐标，lgL为横坐标，作图，斜率n即是络合物中L:M的比值；纵轴上的截距lgK是络合物的稳定常数。,lgK+nlgL=lg(MLn/M),lgK+nlgL=lgA/(Amax-A),9.1了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系.吸收曲线定性分析的基础。定量分析的基础朗伯-比尔定律：A=bc=-lgT式中各参数的物理意义，定量计算。9.2了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本部件。9.3灵敏度的表示摩尔吸光系数的意义和计算；准确度适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。9.4显色反应及条件的确定:显色剂用量、酸度、时间、温度、干扰及消除。9.5应用:单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。,第9章小结,第四节光度分析的步骤一、显色剂的选择（1）反应的选择性好，干扰少，或干扰容易消除。（2）生成的有色化合物有较高的摩尔吸光系数，灵敏度足够高，适用于试样中待测物质的含量范围。,二、实验条件的选择（一）溶液的酸度酸度直接影响显色剂的浓度和生成物的颜色。（二）显色剂用量为了使显色反应进行完全，需加入过量显色剂，在实际工作中，通常根据试验来确定。,（三）显色时间及颜色的稳定性必须通过试验来确定在最合适的时间内进行测定。（四）温度大多数的显色反应在室温下进行，但有些显色反应必须加热至一定的温度和一定时间才能完成。,（五）溶剂有机溶剂对显色反应的影响为：（1）影响络合物的离解度；（2）影响反应速度。,（六）干扰物质的影响及消除方法（1）干扰物质本身有颜色或与显色剂形成有色化合物，在测量条件下也有光吸收。（2）在显色条件下，干扰物质析出沉淀或使溶液混浊，以致无法进行光度测量。（3）与待测离子形成更稳定的络合。,消除办法：（1）控制酸度；（2）加入适当掩蔽剂；（3）选择适当的测量波长；（4）选择适当的参比溶液。,三、分析波长的选择（1）如果不存在其它有色物质的干扰，则选择待测有色物（或显色剂生成的产物）的最大吸收波长的光波作为入射光进行光度测定。,（2）如果显色剂本身有颜色，且在有色物质的最大吸收波长下也有光吸收，最好选择有色物质有较大光吸收的波长而显色剂（或其它有色物质）在此波长下的光吸收为零的单色光作为入射光。,四、参比溶液的选择（1）当试液本身及显色剂均无色，可用蒸镏水作参比溶液。（2）显色剂无色，但待测试液中有其它有色物质存在，可采用不加显色剂的待测试液作参比溶液。（3）如显色剂有颜色，则要用试剂空白（不加试样溶液）作参比溶液。,（4）如显色剂和试液均有颜色，则可取两份试液，其中一份先加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽使之不与显色剂作用，然后两份试液都加入显色剂及其它试剂，将加入掩蔽的那份试液作参比溶液。,五、标准曲线的制作配制一系列不同含量的标准溶液，分别置于比色皿内，选择合适的入射光波长，用参比溶液调整光度计的零点，然后把入射光照射到盛有标准溶液的比色皿上，测得吸光度值。根据标准溶液中待测组分的量对吸光度作图得一直线叫标准曲线。测量的吸光度最好在：0.2-0.8范围内,第五节朗伯-比耳定律的偏离一、非单色光引起的偏离朗伯-比耳定律只适用于单色光，单色光的纯度与仪器的质量有关，性能好的分光光度计，所得的入射光的波长范围较窄，即“单色光”纯度较高，标准曲线的线性范围也大。,二、溶液本身的化学因素引起的偏离（一）溶液中的化学反应（1）生成络合物的浓度不同；（2）剩余显色剂量多少不同和离解程度不同。,（二）介质的不均匀性不均匀的介质主要包括：（1）待测试液是胶体溶液；（2）待测试液是乳浊；（3）待测试液有悬浮物。,第八节吸光光度法的应用一、单组分或多组分的分光测定要求:要求两种或两种以上的有色物质的吸收光谱有较大的差异，最大吸收峰位置有相当距离即可。,吸光度的加和性：如果两个组分的吸光质点对某一波长的单色光均有吸收作用，而且这两种吸光质点之间相