细胞培养工程-02B-相关细胞生理

1,前言,决定重组蛋白质表达的主要因素表达载体表达载体整合位点：宿主细胞染色体转录活跃区低于3%克隆筛选合成蛋白质产物的能力的评估单位时间内每个细胞分泌蛋白质的数量经克隆筛选后，细胞株为单克隆，其合表达能力基本上已经达到上限，进一步重复筛选、提高产率的空间不大过程开发与优化确定产物合成与细胞生长的关系通过反应器操作与培养基优化，（1）提高活细胞密度（2）延长高密度培养时间,1,细胞培养工程南开大学,2,代谢途径,代谢途径胞内生化反应是在酶催化作用下完成胞内生化反应不是独立的，而是相互联系、并接受调节（如负反馈抑制），一个反应的产物往往就是下一个反应的底物，由此构成的一连串生化反应，即代谢途径,细胞培养工程南开大学,3,生物体内代谢活动主要分类,分解代谢由较大分子（多糖、蛋白质、脂类等）降解为小分子（如CO2、NH3、H2O、氨基酸、单糖）的过程作用为细胞的生命活动提供能量为合成代谢提供多种前体物质合成代谢由小分子（如氨基酸等）合成大分子（如蛋白质）的过程作用产生重要的产物为机体生长和产物合成提供必要的大分子物质需要能量,细胞培养工程南开大学,4,正常机体的能量代谢,在正常机体内代谢受严格调控，处于动态平衡状态代谢途径中关键限速酶的活性调节（酶活性）和合成调控（酶数量）是代谢调节主要方式机体内代谢调控层次整体水平：主要通过神经-内分泌系统来实现细胞水平：主要由代谢底物、产物的多少来完成,细胞培养工程南开大学,5,GlycerolAlanineLactate,Intestine,Pancreas,TriosephosphateGlucoseGlycogenGlucose,Pyruvate,Glucose,Insulin,Glucose,GlucoseUDP-GlucoseGlycogen,GlucoseTGGlycerol,RBSc,Adipose,Muscle,Liver,Lactate,Alanine,人体通常状态,细胞培养工程南开大学,6,GlucoseGlycogen,FACO2,TGFA,Adipose,Muscle,Liver,Fattyacids,Glucose,GlucoseCO2,Brain,人体饥饿状态,FACO2,Kidney,细胞培养工程南开大学,7,细胞体外培养代谢,在体外培养中，由于缺少整体水平的代谢调节和组织间的代谢协调作用，细胞自身代谢失去严格调节，常常出现代谢溢流，导致副产物积累，不但浪费原料、恶化细胞生长环境，而且降低细胞培养过程的效率和产率体内空腹血糖：3.9-6.2mM餐后1小时：7.8-9.0mM餐后2小时：3.9-7.8mM细胞培养：一般低于25mM在体外培养中，大多数细胞往往不能利用大分子营养物，而是以小分子如葡萄糖、氨基酸作为代谢的起点底物，通过糖酵解、三羧酸循环等能量代谢途径，分解葡萄糖或氨基酸，为细胞的生长和产物的合成提供必需的能量,细胞培养工程南开大学,8,细胞体外培养代谢,能量代谢以及其它代谢途径（如磷酸戊糖途径）的中间代谢产物，是合成代谢的前体物质分解代谢是一个发散的过程，而合成代谢是一个集合过程合成代谢一般不是分解代谢的简单逆向反应，而是由不同酶催化，通常需要消耗ATP，并以NADPH为主要的还原供氢体了解体外培养细胞的代谢特点，并在此基础上提出相应的代谢调节策略，对提高细胞培养的效率具有重要意义,细胞培养工程南开大学,9,糖代谢葡萄糖转运,葡萄糖不能以直接扩散方式进入细胞在动物体内，葡萄糖可以通过与Na+共转运方式，逆浓度梯度转运至胞内，但需要耗能通过细胞膜上特定转运载体（葡萄糖转运子）将葡萄糖转运入细胞内，顺浓度梯度转运至胞内，不需要耗能在体外培养的细胞中，葡萄糖主要通过葡萄糖转运子进入细胞,细胞培养工程南开大学,10,糖代谢葡萄糖转运蛋白质,葡萄糖转运蛋白质膜蛋白质，协助葡萄糖跨膜转运至少有5种亚型（GLUT-1to5）Glut2：细胞/肝脏Glut4：脂肪组织/肌肉组织；当在胰岛素与脂肪、肌肉细胞表面胰岛素受体结合之后，引起GLUT-4外迁至细胞表面，加速葡萄糖转运（吸收）对葡萄糖的亲和力：Km值约为5mM除脂肪和肌肉组织外，一般细胞内外葡萄糖处于平衡状态,细胞培养工程南开大学,11,糖代谢葡萄糖磷酸化,已糖激酶催化糖酵解途径的第一个不可逆反应作用：催化葡萄糖、果糖、甘露糖、氨基葡萄糖的磷酸化反应（不可逆），生成相应的6-磷酸酯，使其不再逸出需要消耗ATP和反应激活剂Mg2+类型：同工酶I-III型主要存在于肝外组织，对葡萄糖的Km值为10-3-10-2mM，但对果糖亲和力很低同工酶IV型主要存在于肝脏，特称葡萄糖激酶，对葡萄糖的Km值为10-2-1M,细胞培养工程南开大学,12,糖酵解途径,葡萄糖+2ADP+2NAD+2丙酮酸+2ATP+2NADH,NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化型辅酶I）NADH（还原性辅酶I）,细胞培养工程南开大学,13,有氧氧化-三羧酸循环,FAD黄素腺嘌呤二核苷酸FADH,乙酰CoA3NADH+GTP+FADH+2CO2,细胞培养工程南开大学,14,缺氧氧化乳酸脱氢酶,乳酸脱氢酶,丙酮酸+NADH乳酸,细胞培养工程南开大学,15,有氧氧化-呼吸链,线粒体内,缺氧氧化：葡萄糖2乳酸+2ATP有氧氧化：葡萄糖6CO2+36ATP,细胞培养工程南开大学,16,体外培养-三羧酸循环,丙酮酸羧化酶,哺乳动物细胞株缺乏或者酶活力低,进入TCA循环比例低,乳酸,比例高,细胞培养工程南开大学,17,氨基酸代谢,氨基酸底物特性体外培养的动物细胞一般只利用氨基酸、二肽或小分子寡肽，不能利用蛋白质作为细胞生长的营养物氨基酸代谢类型合成代谢：多肽、蛋白质及其它含氮物质合成分解代谢：为细胞的生命活动提供能量氨基酸分类必需氨基酸：构成人体蛋白质的氨基酸中，有些不能直接在人体合成，只能在植物及微生物体内合成，并通过食物摄取进入人体非必需氨基酸：其余的氨基酸可利用代谢中间产物合成，或者由必需氨基酸转化而成,细胞培养工程南开大学,18,氨基酸代谢,细胞体外培养细胞直接利用培养基中的氨基酸，而无需合成氨基酸的代谢调控主要是针对氨基酸的合理利用氨基酸通过分解、氨基转移或其他途径，也可生成其它氨基酸（如丙氨酸、谷氨酸），因此大多数培养基不包括这些氨基酸，其中丙氨酸也是细胞培养中典型的代谢副产物由于细胞对于某些氨基酸有较高数量要求，细胞生物合成不能满足需要，因此体现“必需氨基酸”特征,细胞培养工程南开大学,19,氨基酸代谢,氨基酸结构-氨基-羧基不同的侧链基团（R）不同的氨基酸结构不同，因此它们的代谢也有各自的特点分解代谢的主要途径是脱氨基或转氨基，生成相应的-酮酸、氨或另一种氨基酸氨具有明显的细胞毒性，在体内主要以尿素形式排出在体外培养中，氨作为代谢终产物而在培养环境中积累氨基酸在脱氨基后生成的酮酸可进一步氧化分解，生成CO2和H2O并提供能量,细胞培养工程南开大学,20,氨基酸的脱氨基作用（1）,氨基酸在酶的催化下脱去氨基生成-酮酸的过程氧化脱氨基作用：在酶的催化下，氨基酸在氧化脱氢的同时脱去氨基的过程如谷氨酸在线粒体中由谷氨酸脱氢酶催化氧化脱氨该反应为可逆反应。一般情况下偏向于谷氨酸的合成，但当谷氨酸浓度高而NH3浓度低时，则有利于脱氨和-酮戊二酸的生成。在细胞的体外培养中，谷氨酸的代谢也受到谷氨酰胺浓度的影响。,细胞培养工程南开大学,21,氨基酸的脱氨基作用（2）,转氨基作用：在转氨酶催化下，将-氨基酸的氨基转给另一个-酮酸，生成相应的-酮酸和一种新的-氨基酸。除甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸和脯氨酸不参加转氨基作用外，其余均可由特异的转氨酶催化参加转氨基作用。细胞培养中，最重要的氨基受体是-酮戊二酸、丙酮酸和草酰乙酸，生成相应的谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸。在体外培养细胞中，由于有丰富的丙酮酸来源，主要的氨基酸代谢副产物是丙氨酸。丙氨酸的积累不会给细胞培养带来不良的副作用，而脱氨产生的游离氨达到一定浓度时，可带来严重的细胞毒性作用。,细胞培养工程南开大学,22,氨基酸的脱氨基作用（3）,联合脱氨基作用由L-谷氨酸脱氢酶和转氨酶联合催化的联合脱氨基作用在转氨酶催化下，将某种氨基酸的-氨基转移到-酮戊二酸上生成谷氨酸；然后，在L-谷氨酸脱氢酶作用下，将谷氨酸氧化脱氨生成-酮戊二酸，而-酮戊二酸再继续参加转氨基作用（可逆反应）嘌呤核苷酸循环骨骼肌和心肌中含丰富的腺苷酸脱氨酶，能催化腺苷酸加水、脱氨生成次黄嘌呤核苷酸（IMP）。一种氨基酸经过两次转氨作用可将-氨基转移至草酰乙酸生成天冬氨酸，天冬氨酸又可将此氨基转移到次黄嘌呤核苷酸上生成腺嘌呤核苷酸（不可逆反应）该代谢途径将氨基酸代谢与糖代谢、脂代谢、核苷酸代谢联系起来,23,非氧化脱氨基作用脱水脱氨基丝氨酸可在丝氨酸脱水酶的催化下生成氨和丙酮酸。苏氨酸在苏氨酸脱水酶的作用下，生成-酮丁酸，再经丙酰辅酶A和琥珀酰CoA参加代谢脱硫化氢脱氨基半胱氨酸可在脱硫化氢酶的催化下生成丙酮酸和氨直接脱氨基天冬氨酸可在天冬氨酸酶作用下直接脱氨生成延胡索酸和氨氨基酸脱氨基代谢产生的游离氨将在培养基中积累，达到一定的浓度时将造成对细胞的毒性作用。因此，利用过程优化或基因工程的手段，降低培养中游离氨的生成是细胞培养工程的重要研究内容。,氨基酸的脱氨基作用（4）,24,-酮酸的代谢（1）,氨基酸经联合脱氨或其他方式脱氨所生成的-酮酸，可经过联合加氨反应生成相应的氨基酸8种必需氨基酸中，除赖氨酸和苏氨酸外，其余6种亦可由相应的-酮酸加氨生成。相对应的-酮酸不能在体内合成，但可氧化生成CO2和水，这是氨基酸作为能源物质代谢的必要途径。-酮酸通过一定的反应途径先转变成丙酮酸、乙酰CoA或三羧酸循环的中间产物，再经过三羧酸循环彻底氧化分解。,细胞培养工程南开大学,25,氨基酸代谢途径（2）,细胞培养工程南开大学,26,谷氨酰胺的代谢,动物细胞培养中最重要的氨基酸细胞培养基中重要能源物质之一；在培养基中浓度最高，通常是其它氨基酸的10倍；作为细胞生物合成中氮的主要来源，核酸中嘌呤、嘧啶和氨基糖中的氮来自谷氨酰胺；作为碳源直接参与细胞大分子物质的合成；其存在可促进其它氨基酸的运输和利用。血清具有谷氨酰胺酶活性，产生氨高浓度谷氨酰胺倾向于产生氨与乳酸，利用率低。,细胞培养工程南开大学,27,细胞培养过程的代谢调控,目的：优化细胞的生长环境，降低培养过程中代谢副产物积累，提高细胞密度、产物产量和质量代谢调控的主要方式：培养基优化：通过优化胞外营养物的浓度控制来调节细胞内的代谢途径或物料通量反应器操作方式：补料（流加过程）代谢工程：通过基因工程方法，人为干预细胞原有的代谢途径或引入新的代谢途径，以调节胞内的代谢途径或物料通量,细胞培养工程南开大学,28,培养基的优化葡萄糖,在体外培养的细胞中，葡萄糖磷酸化（糖酵解的第一步反应）失去有效控制，速率过高，导致过高的糖酵解通量，因此生成大量丙酮酸能进入TCA循环的丙酮酸只占极少部分，大部分的丙酮酸在胞质中积累，在乳酸脱氢酶的作用下转化成乳酸高通量的糖酵解是导致乳酸积累的主要原因措施：将细胞维持在较低葡萄糖浓度的培养基中，可以减少甚至消除乳酸积累,杂交瘤细胞CRL-1606：葡萄糖浓度控制在2mM时，乳酸对葡萄糖的得率系数为0.1mol/mol葡萄糖浓度控制在0.2mM时，乳酸对葡萄糖的得率系数为0.067mol/mol二者均低于正常培养过程中乳酸对葡萄糖的得率系数注：每个葡萄糖分子最高能产生两个乳酸分子,细胞培养工程南开大学,29,培养基的优化谷氨酰胺（1）,在细胞培养中，谷氨酰胺不稳定，可以自降解如果谷氨酰胺浓度高，细胞也会过量利用，导致氨积累措施：控制培养基中的谷氨酰胺浓度，可以有效降低氨的积累，改善细胞的生长环境,细胞培养工程南开大学,BHK细胞连续培养当谷氨酰胺浓度为0.52mM，比消耗速率0.5510-6nmole/细胞/分钟当谷氨酰胺浓度为0.14mM，比消耗速率0.2810-6nmole/细胞/分钟消耗速率的下降，导致氨积累浓度从0.6mM减少至0.4mM与葡萄糖代谢不同，氨对谷氨酰胺的得率系数不随着谷氨酰胺浓度的降低而降低，反而从1.1mol/mol升高到1.5mol/mol由于谷氨酰胺下降，培养基中氨的积累还是随着谷氨酰胺浓度的下降而下降，表明在低谷氨酰胺浓度下，更多的谷氨酰胺经过谷氨酸脱氢酶的途径反应，生成酮戊二酸而进入三羧酸循环,30,葡萄糖与谷氨酰胺之间的相互影响,在能量代谢中，以谷氨