细菌内毒素检查方法研讨

细菌内毒素检查法1 目的该SOP用来判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。2适用范围该SOP适用于中国兽药典要求检查该项的药品和适合中国兽药典要求的其它品种的药品的细菌内毒素检查。3职责进行该项检验的检验员应该按该SOP进行检验，检测室主任负责监督该SOP的正确执行。4检验4.1 技术依据及原理本法系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应即内毒素在二价阳离子的参与下，作用于鲎血凝集酶系统而发生的一系列酶联反应，最后形成凝胶，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。4.1.1 鲎试剂灵敏度复核试验项的目的不仅是考查鲎试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在将一批新的鲎试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核试验。4.1.2 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。4.1.3 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。4.2 注意事项4.2.1 实验前，须用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒4.2.2 实验时，须戴工作帽和口罩。尤其在配制洗液和洗涤玻璃器皿时一定要戴手套、工作帽和口罩。4.2.3 试验应在洁净室或洁净工作台内进行。4.2.4 用移液管或刻度吸管等吸取样品时，须使用洗耳球，勿用嘴吸、吹，防止唾液溅入。也可使用加样器等其它方法。4.2.5 注意所用鲎试剂的批号、有效期、规格、灵敏度等。4.2.6 进行干扰实验时，标准对照和供试品阳性对照（含供试品的内毒素溶液）应同时进行。4.2.7 在进行灵敏度复核、干扰试验和供试品内毒素检查时，各个实验所要求的对照应同时进行，并在有效的条件下才能进行计算和判断。4.3 材料、仪器、试剂的准备及基本要求4.3.1 天平 供试品称量用，感量为0.1mg以下。4.3.2 电热干燥箱 除外源性内毒素用，温度应能维持250以上至少一小时。4.3.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在371保持一小时。4.3.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1以下。4.3.5 旋涡混合器4.3.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。4.3.7 细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（WSE）。4.3.8 细菌内毒素检查用水（BET水） 系指与灵敏度为0.03Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂在371条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。4.3.9 实验用具 移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（1075mm）、三角瓶、小试管（16100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。4.3.10 试剂 75%乙醇、纯化水、铬酸洗液。4.4 检验步骤4.4.1 试验准备4.4.1.1 洗液的配制 配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。4.4.1.2 玻璃器皿的洗涤 将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜纯化水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。4.4.1.3 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素 玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250，待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。4.4.2 鲎试剂灵敏度复核4.4.2.1 内毒素标准溶液的制备4.4.2.1.1 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。4.4.2.1.2 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0、1.0、0.5、0.25（为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。例如使用NSE（内毒素含量为9000EU/支）时的方法如下：复溶：准确吸取BET水1ml加入NSE的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为9000EU/ml内毒标标准溶液。稀释：取0.3ml内毒素标准溶液加上2.7mlBET水即为110稀释液，得到900EU/ml内毒素标准液。取0.3ml110稀释液，加上2.7mlBET水即为1100稀释液，得到90EU/ml内毒素标准溶液。往后依次类推，也可写成下列格式：0.3ml 0.3ml 0.3ml 0.3ml 1ml 1ml9000EU/ml 900EU/ml 90EU/ml 9EU/ml 1EU/ml0.5EU/ml 2.7ml 2.7ml 2.7ml 2.4ml 1ml 1ml1ml 1ml 1ml0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.0625EU/ml 0.03125EU/ml1ml 1ml 1ml在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。4.4.2.2 待复核鲎试剂的准备4.4.2.2.1 在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mlBET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。4.4.2.2.2 若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.1ml分配到1075mm凝聚管中，要求至少分配18管备用。4.4.2.3 加样4.4.2.3.1 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4列分别加入2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素标准溶液；2支（管）1列分别加入BET水。内毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.1ml/支。4.4.2.4 加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入371水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温602分钟，观察结果。4.4.3 干扰试验4.4.3.1 供试品细菌内毒素限值（L）的确定4.4.3.1.1 按供试品标准规定限值4.4.3.1.2 供试品最大有效稀释倍数的计算：MVDCL/L为供试品的细菌内毒素限值，为测试用鲎试剂的灵敏度标示值，C表示供试品的浓度，或供试品复溶后所得溶液的浓度。当L以EU/ml表示时C为1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/u表示时，C为mg/ml或u/ml。如需计算供试品的测试浓度C，可设MVD为1。4.4.3.2 内毒素标准溶液的制备同4.4.2.1。4.4.3.3 含供试品的内毒素溶液的制备4.4.3.3.1 根据供试品的限值（L）和使用鲎试剂的灵敏度（）计算供试品测试浓度（C）或MVD。4.4.3.3.2 将供试品稀释，其稀释倍数不应超过MVD，并通过预试验确定正式试验供试品测试浓度。4.4.3.3.3 在制备内毒素标准溶液的同时用未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数的稀释液将WSE以相同方法制备成所需浓度的含供试品的细菌内毒素溶液（2.0、1.0、0.5、0.25）。4.4.3.3.4 简化法制备含供试品的细菌内毒素溶液 取0.5ml内毒素标准液（1.0EU/ml）0.5ml供试品溶液（10mg/ml）1ml0.5EU/ml（5mg/ml）含供试品内毒素溶液。同理分别用0.5ml浓度为0.5EU/ml、0.25EU/ml和0.125EU/ml的内毒素标准溶液加入0.5ml浓度为10mg/ml的供试品溶液制备0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.0625EU/ml含5mg/ml浓度的供试品阳性对照溶液（其体积大小根据试验所需量而定）。4.4.3.4 鲎试剂的准备4.4.3.4.1 在制备内毒素标准对照溶液和含供试品的内毒素溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂36支轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mlBET水复溶，轻轻摇动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。4.4.3.4.2 若鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入水复溶，将复溶后的鲎试剂混匀后每0.1ml分配到1075mm凝集管中，要求至少分配36管备用。4.4.3.5 加样4.4.3.5.1 将准备好的鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4列分别加入2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素标准对照溶液；2支（管）1列加入BET水。4.4.3.5.2 将准备好的另外18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4列分别加入2.0、1.0、0.5、0.25的含供试品的内毒素溶液；2支（管）1列加入供试品溶液。4.4.3.5.3 内毒素标准溶液和BET水、含供试品的内毒素溶液和供试品溶液的加样量均为0.1ml。4.4.3.6 加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入恒温水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态保温602分钟后，观察结果。4.4.3.7 在进行正式干扰试验前可进行预试验，用L和（通常用0.50.03EU/ml）计算出C的范围，以12的浓度比例，制备含2和0.25的系列浓度供试品溶液，每一浓度取2支（管）鲎试剂进行试验，判定无干扰浓度进行正式干扰试验。4.4.4 供试品细菌内毒素的检查4.4.4.1 供试品溶液的制备4.4.4.1.1 计算 MVDCL/。C、L、的意义同4.4.3.1.24.4.4.1.2 稀释 其稀释倍数不得超过MVD。4.4.4.2 阳性对照溶液的制备 按4.4.2.1用BET水制成2浓度的内毒素溶液。4.4.4.3 供试品阳性对照液的制备 用被测供试品将WSE制成2浓度的内毒素溶液。方法同4.4.3.3含供试品的内毒素溶液制备。其中利用简化法时，由于供试品原液必须稀释一倍，采用的鲎试剂灵敏度要提高一倍（如输液），供试品浓度也相应调整。4.4.4.4 鲎试剂的制备4.4.4.4.1 在制备供试品溶液、内毒素标准溶液和供试品阳性对照溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂5支，手指轻弹瓶壁，使颈部瓶壁上的粉末落入瓶内，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mlBET水复溶，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。4.4.4.4.2 若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.1ml分配到1075mm凝集管中，要求至少分配5管备用。4.4.4.5 加样取装有0.1ml鲎试剂溶液的1075mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿5支，其中2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，1支加入0.1ml用BET水将WSE制成的2浓度的内毒素溶液作为阳性对照，1支加入0.1mlBET水作为阴性对照，1支加入0.1ml供试品阳性对照溶液（相当于用被测供试品溶液将WST制成2浓度的内毒素溶液）作为供试品阳性对照管。4.4.4.6 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜闭管口，垂直放入371水浴或适宜恒温器中，试管保持水平状态保温602分钟。保温和拿取试管过程应避免受到震动，造成假阴性结果。4.4.4.7 将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）。4.5 实验记录与计算4.5.1 记录格式如下： 鲎试剂灵敏度复核试验记录（一三综合记录）一、鲎试剂批 号：灵敏度： EU/ml供样单位：规格： ml/支（瓶）生产单位：失效日期： 年 月 日检验目的：灵敏度复核室温： 检验依据：中国兽药典 年版检验日期： 年 月 日检验数量： 支（瓶）二、标准品NSE批号：效价： EU 来源：WSE批号：效价： EU 来源：BET水批号 ml/支 来源：内毒素标准品复溶时的体积为 ml；稀释方法为：三、反应结果（反应起止时间： ）内 毒 素 浓 度 2 0.5 0.25 （ ） （ ） （ ） （ ）阴性对照反应终点浓度重 1复 2管 3数 4结果是否有效计算结果：结果判断检验人员签名校对人员签名干扰试验记录（一五综合记录）一、供试品检品名称：检品数量： 支（瓶）批 号：规 格：生产单位：供样单位：检验目的：干扰试验检验依据：中国兽药典 年版供试品溶液的制备：二、鲎试剂批 号：灵敏度： EU/ml供样单位：规 格： ml/支（瓶）生产单位失效日期： 年 月 日灵敏度复核日期；结果： EU/ml三、标准品NSE批号：效价： EU 来源：WSE批号：效价： EU 来源：BET水批号： ml/支 来源：内毒素标准品复溶时的体积为 ml；稀释方法为：四、含供试品内毒素溶液的制备五、反应结果（反应起止时间： ）内 毒 素 浓 度 2 0.5 0.25 （ ） （ ） （ ） （ ）阴性对照反应终点浓度重 1标准复 2对照管 3数 4重 1供试复 2品阳管 3性对数 4照结果是否有效计算结果：结果判断检验人员签名校对人员签名供试品细菌内毒素检查（一五综合记录）一、供试品检品名称：检品数量： 支（瓶）批 号：规 格：生产单位：供样单位：检验目的：内毒素检查 检验依据：中国兽药典 年版检验人员：校对人员供试品溶液的制备：二、鲎试剂批 号：标示灵敏度： EU/ml供样单位：规 格： ml/支（瓶）生产单位：失效日期： 年 月 日灵敏度复核日期：复核结果： EU/ml三、标准品NSE批号：效价： EU 来源：WSE批号：效价： EU 来源：BET水批号： ml/支 来源：内毒素标准品复溶时的体积为 ml；稀释方法为：四、供试品阳性对照溶液的制备五、反应结果（反应起止时间： ）供 试 品 管供试品管阴性对照2.0供试品阳性对照结果是否有效结 果结果判断检验人员签名校对人员4.5.2 鲎试剂灵敏度复核如最大浓度2.04管均为阳性，最低浓度0.254管均为阴性，阴性对照为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（C）。clg1（X/4）式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。4.5.3 干扰实验如标准溶液最大浓度2.04管均为阳性，最低浓度0.254管均为阴性，阴性对照为阴性，按下式计算用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。Eslg1（Xs/4）Etlg1（Xt/4）式中Xs、Xt分别为BET水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。4.6 结果判定4.6.1 鲎试剂灵敏度复核当c在0.52.0（包括0.5和2.0）时，方可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。4.6.2 干扰实验当Es在0.52.0（包括0.5和2.0）时，且当Et在0.5Es2.0Es（包括0.5Es2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，否则使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大倍数稀释，这是排除干扰因素的简单有效的方法（也可采用过滤法，干扰因素去除法等其他方法）。建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上生产厂家的鲎试剂进行干扰试验。若各批供试品干扰实验结果差别较大时应考虑供试品内毒素的影响。若鲎试剂的来源、供试品的配方或生产工艺有变化时，须重复进行干扰实验。4.6.3 供试品细菌内毒素检查供试品2管均为（），应认为符合规定。如2管均为（+），应认为不符合规定；如2管中1管为（+），1管为（），按上述方法另取4支供试品复试，4管中1管为（+），即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管为（+）或2管中1管为（+