MTT法小结课件.ppt

MTT法检测细胞活力,细胞毒性检测,细胞形态学观察,细胞生长状态观察,细胞活性检测,MTT法目的和意义,检测细胞存活和生长情况用于评价药物产生的细胞毒作用,原理,四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。,活细胞+MTT,琥珀酸脱氢酶,紫蓝色结晶物Formazan,贴壁细胞操作步骤,1.接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000-6000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积50ul。（边缘孔用空白培养基填充）。2.培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37、5%CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药50ul，一般设3个复孔。3.5%CO2，37孵育20小时，倒置显微镜下观察。,4.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）,悬浮细胞操作步骤：,1）调节细胞悬液浓度1106/ml，按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul；加ActinomycinD（有毒性）10ul用培养液稀释lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物10ul；细胞悬液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照。2）置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3）每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后直接测），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。,药物的配制,浓度体积过滤,MTT的配制,MTT一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60水浴助溶。,实验结果统计学处理,所有数值以xs表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50（半数抑制浓度）。或计算抑制率。OD对照组-OD实验组细胞死亡率%=OD对照组,100%,注意事项,1选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。,实验前应明确的问题,1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。,2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3.时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。,4.培养时间。200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。,7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含15胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。,关于细胞的接种(铺板),细胞过了30代以后就不要用了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种,且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104。,MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。,如何清除上清,直接吸出：加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)。翻转倒扣法：可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）23次，比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，但前提是细胞贴壁要比较牢。,加入DMSO,在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.加了DMSO后用振荡器轻轻振荡510min,时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信.加入DMSO溶解后尽快检测。,OD值的测定,至于测定波长的选择是因显色溶液而异的。对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值。DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变。细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。,材料,（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4）5.倒置相差显微镜6.CO2培养箱7.振荡混合仪8.酶联免疫检测仪9.移液枪10.电磁力搅拌机11.微孔滤器（二）玻璃器皿1.吸管2.小烧杯（100ml）3.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.96孔培养板4.15ml离心管5.10ml离心管6.胶塞（四）其他物品1.微量加样枪2.红血球计数板（五）试剂1.含血清的培养基.2.0.08%胰酶3.二甲基亚砜（DMSO）4.MTT溶液,细胞数目6000100=6105细胞体积200ul100=20ml细胞密度0.3105药物浓度20