《酶免检测技术影响》PPT课件.ppt

酶免检测技术影响因素,检验科马燕,酶免技术的分类实验注意事项实验中常见问题及解决方法,均相法双抗原夹心法（测抗体）直接法双抗体夹心法（测抗原）酶免法间接法测抗体、抗原EIA非均相法ELISA竞相法测抗体、抗原捕获法测IgM抗体enzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定法,酶免技术的分类,双抗体夹心法HBsAg、HBeAg双抗原夹心法HBsAb,夹心法,HBcAb、HBeAb,竞争法,HDVIgG/M、HEVIgG/M测IgG测IgM,间接法,HAV-IgM,捕获法测IgM,实验注意事项,1、标本避免溶血尽量新鲜，避免细菌污染一般5天内检测的血清可4保存，否则低温保存。,2、试剂使用前平衡至室温配置洗液应使用去离子水或蒸馏水，保证水的新鲜3、设计实验设计好孔位，通常阴阳对照孔各2孔、空白1孔。必要时做好标注，避免错误,4、加样样品应全部加于反应孔底部，避免液体悬挂在孔壁上。加样量准确！加下一标本时更换吸嘴,5、加酶结合物一般使用滴瓶滴加滴加时应保持瓶身垂直、加液速度适中，使液滴大小均匀一致一步法时先加样本后加酶，不可颠倒顺序一般空白孔只加底物和终止液，而不能加入其它物质，尤其是酶结合物,6、温育温度、时间要严格控制！最好使反应杯尽快升温到所需温度最好放入湿盒或水浴箱中反应板贴上即时贴微孔板放入水浴箱后，孔内温度上升到37需要一定时间。但实际工作中很少有人注意这个问题，通常是放入即计时，导致实际温育时间不够，弱阳性标本漏检。解决：微孔板放水面上或湿盒中纱布浸透水，使板底部直接与37接触，迅速达到温度。,7、洗板使用专用洗涤液一般洗涤46次若手工洗涤，前两次洗涤应不溢出反应孔污染后面几次洗涤应加满所有孔干净每次加洗涤液后应浸泡30秒再甩去洗液反应板倒扣吸水纸上拍干洗板时应注意非离子去垢剂的浓度。洗液中Tween20高于0.2%,可使包被子固相上的抗体抗原解吸附而影响测定下限。,8、加底物底物A液通常是H2O2还原剂底物B液通常是TMB（3、3、5、5-四甲基联苯胺）氧化剂TMB氧化后呈蓝色，被2NH2SO4终止后呈黄色，450nm波长处有最大吸收峰底物B应避光保存，实验时加完底物A、B保温时也应避光保存。,9、比色空白孔校零，读取各孔OD值单波长or双波长的选择：单波长通常是对显色具有最大吸收的450nm或492nm双波长酶标仪则在敏感波长450nm和非敏感波长630nm下各测定一次。使用双波长时不必设定空白孔，否则会造成孔吸光度数为负数。若底物为OPD（邻苯二胺），波长为492nm若底物为TMB，波长为450nm,10、结果判读不同试剂，CUTOFF值计算方法不同,常见问题及解决办法,内源性标本因素：1、类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgGFc段非特异结合，因此可能与包被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。2、补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低3、异嗜性抗体：人血清中含有抗齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。4、溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。外源性标本因素：1、溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与HRP显色。2、细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作用，并且细菌引起标本混浊。3、标本4存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议1周4、标本凝固不全：残留纤维蛋白原