《蛋白质复性》PPT课件.ppt

第十章蛋白质复性refolding,提纲,变性与复性包涵体的形成和性质包涵体的纯化和溶解蛋白质的复性蛋白质体外复性的常用方法,1.变性unfolding与复性refolding,变性过程总伴随着蛋白质的物理、化学、生物学性质的变化，如溶解度改变、体积变大、黏度增加、扩散系数降低、生物活性降低或消失等。蛋白质变性时肽链伸展而失去特定的空间结构，这一过程称为肽链的伸展或去折叠。随着这一过程的进行，整个分子也由天然蛋白质紧密的、球状或近球状结构伸展为松散的无一定空间结构的链状分子。许多变性蛋白质在去除变性因素后，可自发地恢复它原来的空间结构和生物活性，这称为变性蛋白质的再折叠或复性。（p384）,复性有关理论,蛋白质从去折叠状态向折叠状态即天然状态转变的过程中，必须经历一个高自由能的过渡态。蛋白质复性过程中能量变化示意图,复性有关理论,在这个过渡态中蛋白质可有多种构象形式，而天然状态蛋白质可能有一种或有限的几种构象状态存在。蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是“热力学假说”。该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性，其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋白质的天然构象应是能量最小构象。,复性有关理论,大量研究还发现，许多蛋白质在体外的变性复性过程并非完全可逆，且体外复性速度远比体内低，多肽链折叠过程中受到许多因素的限制，如S-S键重排和脯氨酰顺反异构等都是折叠反应的限速步骤，实际多肽链在折叠过程受到动力学控制。蛋白质在折叠过程中会有两种途径相互竞争，一种是正确折叠形成天然构象的途径，另一种是错误折叠成稳定的非天然构象的途径。蛋白质多肽链的正确折叠是一些因素在折叠动力学过程中起到控制作用。,复性有关理论,“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同，各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排，脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。,复性有关理论,两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构的蛋白质分子。按拓扑学观点认为：虽然蛋白质内部基团相互作用复杂，使得不同蛋白质的折叠复性过程不相同，但不同蛋白质多肽链穿越空间的形式可能会是相同或类似。实验中也发现，蛋白质拓扑结构的氨基酸序列不改变对蛋白质的折叠速度等参数影响很很少。因此，该理论认为，蛋白质的折叠过程的许多参数及其折叠机理可能与蛋白质的拓扑结构有密切关系。,2.包含体的形成和性质,在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物,包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约0.5-1m，具有很高的密度（约1.3mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。,包涵体形成的几种可能性,研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞内溶解度时沉淀；2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译后修饰酶及分子伴侣等)不足；4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵体。5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。6）丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。,减少包涵体形成的策略,1）降低重组菌的生长温度：较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。2）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，如：培养E.coli时添加乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）等。3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。4）将目标蛋白与亲水蛋白、分子伴侣、折叠酶等共表达；,包涵体形成：Advantages,1、细菌的生长快速利于大规模生产。包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的40%,2、重组蛋白质以包涵体形式存在包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击,3、分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离,4、有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性高效地表达,3.包涵体的纯化和溶解,路线二A,发酵液预处理,细胞分离,包涵体加工流程,离心,去除细胞碎片（膜蛋白和脂类等）,机械破碎法,包涵体提取,如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化的一个难题,包涵体的洗涤,为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀常用去污剂TritonX-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。如：50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，2M尿素，1mMEDTA,包涵体的溶解,大多数在pH8的条件下，用强变性剂如8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展对于含有S-S的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。为将包涵体充分溶解，需加入还原剂（如二硫苏糖醇DTT、GSH、巯基乙醇-ME）打开蛋白质中所有二硫键，一般是50-100mM-ME或DTT（对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，因为含S-S的杂蛋白会影响包涵体的溶解）加入金属螯合剂，如EDTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子，防止已经处于还原状态的SH-与之发生氧化反应。包涵体溶解后，蛋白质成为失去了生物学活性伸展肽链,4.蛋白质复性,蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用：一是分子内的疏水相互作用促使蛋白质正确折叠二是肽链分子间的疏水相互作用导致蛋白质分子间聚集，形成寡聚体和多聚体再进一步聚集形成沉淀,两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。,伸展态U,中间体I,聚集体A,天然态N,快,慢,影响复性效率的因素,1）蛋白质本身的性质有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11；一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右2）蛋白质的复性浓度I向N的转化是一级反应，而聚沉是二级或多级反应聚沉的反应速度与蛋白质浓度的平方或高次方成正比而复性反应过程与蛋白质浓度的一次方成正比，故浓度越大，聚沉反应越明显。复性时蛋白质浓度宜低（低浓度时，获得的蛋白质复性效率比高浓度要好的多）浓度过低又给后处理带来不便，一般选择10100gml，以避免分子间相互作用力引起聚集。,3）变性剂浓度和复性时间在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L盐酸胍、8mol/LUrea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的疏水相互作用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用的形成。由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一段时间，I就可以慢慢地向N转化4）氧化还原环境复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形成S-S的环境合适的氧化还原环境采用配对的氧化型和还原型巯基物质配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基乙醇/胱氨酸等。通常还原型巯基物质的使用浓度为l3mmol/L，还原型/氧化型的摩尔比为10：1或5：1。,5）pH和温度最适宜的复性pH值应大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自由SH-的质子化作用影响正确配对的S-S的形成。应避免在蛋白质pI处进行复性（蛋白质的静电排斥力几乎为零，相互间疏水作用区域就容易作用而形成A）。温度过高，蛋白质的聚集将十分严重，低温下聚集和折叠反应都很慢，随着温度的上升二者的速度都加快常在室温下进行6）折叠促进剂能够促进蛋白再折叠的化学物质统称为折叠促进剂，折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、抑制肽链间的疏水相互作用。应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂、聚乙二醇PFG、L精氨酸、抗体、分子伴侣等。,例：人-干扰素的后处理工艺,发酵液离心(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min)菌体细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBSbuffer,冰浴超声破碎5次,30s/次,4000r/min离心30min)，洗涤(0.1%TritonX-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次)包涵体提取变性(包涵体+8M尿素pH8.050mMTris-HClbuffer0.2mMEDTA,10mMDTT室温搅拌2h,离心(15000r/min,30min),例：人-干扰素的后处理工艺,变性蛋白液稀释(取1份变性液+99份上述buffer(不含DTT与尿素)，使尿素终浓度小于0.1M，4C下搅拌24h）复性液浓缩(用截留10kDa的超滤器浓缩100倍)，透析后离心(15000r/min离心30min)浓缩上清液Sephacryls-200柱层析分离：层析柱2100cm，pH8.050mMTris-HClbuffer平衡洗脱,5.蛋白质体外复性的常用方法,稀释透析超滤复性法折叠促进剂协助复性法：表面活性剂、PEG、分子伴侣等反相胶团复性法、双水相体系复性法层析折叠复性（固相复性）：凝胶过滤层析（GF）、亲和层析（AFC）、离子交换层析（IEC）、疏水层析（HIC）等,蛋白质复性时聚集反应的抑制,复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构，降低错误折叠蛋白质的稳定性，增加折叠复性中间体的溶解度，增加非折叠蛋白质的溶解度，减少复性中间体接触发生聚集反应。,聚集反应抑制剂的种类：可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍或尿素，以及一些离液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺类化合物等。在非变性浓度下，是很有效的促进剂。对于某些需要辅因子才表现活性的蛋白质，辅因子、配基、或底物具有很好促进折叠的作用。Zn2+和Cu2+可稳定折叠中间体。浓度为0.51.0mol/L的L-精氨酸可大幅度提高折叠效率（使不正确折叠和二硫键不稳定）。PEG促进折叠复性，PEG与复性中间体特异形成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再与PEG结合。天然蛋白质即由第二个中间体形成。在有PEG存在下的所有的折叠反应具有相同的速率，复性率与PEG的分子量及浓度相关。认为PEG的作用与分子伴侣的作用机理相似。,非离子型表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。如Chaps、TritonX-100、磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用。不利是与蛋白质形成胶团，难以去除，影响后续的分离纯化。多离子化合物，如肝素，可促进蛋白质的折叠复性，且有稳定蛋白质天然构型的作用。短链醇类、高渗物，如乙醇、甘油等对蛋白质有稳定作用，可有效降低低聚体的形成。如胰岛素生长因子I的复性，除了在复性液中加入Cu2+和Mg2+、2mol尿素、盐类（1mol/LNaCl、DTT）外，还加入乙醇、甘油等。单克隆抗体，待折叠复性的蛋白质的抗体可有效的协助其复性，但只有该蛋白质的特异抗体有效。它可与待折叠复性的蛋白质的远离活性中心的疏水区域结合，有效阻止无活性聚集体的形成。,分子伴侣和折叠酶，这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶(PDI)、肽酰-脯氨酰顺反异构酶(PPI)、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质折叠复性。由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质复性后要除去，且这类蛋白质又十分昂贵，须采用可回收的方法，如固定化方法。人工伴侣，将变性蛋白质首先加到含表面活性剂的溶液中，以防聚集，然后用环糊精除去表面活性剂，促进折叠复性。这称为人工伴侣复性。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,常用的蛋白质复性添加剂复性添加剂复性蛋白质GdmCl荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，碳酸酐酶II，干扰素-多肽尿素猪生长激素，溶菌酶，IGF-1，干扰素-多肽L-精氨酸荧光假单孢菌脂肪酶，鸡卵清溶菌酶，-糖苷酶盐类(NH4)2SO4溶菌酶糖类甘油荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，IGF-1蔗糖IGF-1葡萄糖溶菌酶N-乙酰基葡糖胺溶菌酶肌氨酸溶菌酶,蛋白质复性时聚集反应的抑制,表面活性剂类ChapsTGF-类蛋白质，碳酸酐酶IITween人生长激素SDS干扰素-多肽月桂酰基肌氨酸钠单链Fv片段十二烷基麦芽糖MHCTritonX-100碳酸酐酶IIPEG碳酸酐酶II十八烯甘油碳酸酐酶II单十二酰基磷酸酯溶菌酶硫代甜菜碱鸡卵清溶菌酶短链醇正戊醇，正己醇，碳酸酐酶环己醇,蛋白质复性的促进剂,分子内没有S-S键的蛋白质复性相对比较简单，只需抑制聚集反应，不涉及S-S键的形成。S-S键的形成需要适当的氧化还原条件，对于稀释复性法，最简单的方法是通入空气，进行氧化形成S-S键，但氧化速度太慢；最常采用的是适当比例的氧化还原对，如GSH/GSSG,形成S-S键，或使错误S-S键重排，促进正确S-S键的形成。在后续步骤加入强的氧化步骤，即加入过量的氧化型巯基试剂，或采用Cu2+诱导的空气氧化，以保证形成正确稳定的S-S键。,多聚-Lys蛋白对肝素-琼脂糖凝胶具有较强亲和活性,吸附,洗脱,固相复性的流程,固相基质：肝素-琼脂糖凝胶,由于凝胶基质微孔的体积排阻效应和减少的扩散效应，部分折叠的蛋白质之间的相互作用受到有效的阻挡降低了发生聚集的可能性可溶性的聚集物、复性的蛋白、变性剂和氧化还原剂依次流出,UsingGF凝胶过滤,固相复性（柱上复性）优缺点,优点：在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；便于回收变性剂，降低废水处理成本。缺点：一旦复性时发生聚沉副反应，使得柱堵塞且不可再生经济损失较大。,展望,研究蛋白质变性复性机理，开发新的变性复性原理和技术，解决目前的技术关键。完善现有技术，实现现有技术的实用化和规模化。根据现有技术原理，扩大应用范围。开发实用的设备。,许多变性蛋白质在去除变性因素后，可自发地恢复它原来的空间结构和生物活性，这称为变性蛋白质的再折叠或复性。包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约0.5-1m，具有很高的密度（约1.3mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。减少包涵体形成的策略:1）降低重组菌的生长温度：较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。2）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，如：培养E.coli时添加乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形