t-DNA鉴定ppt课件

,遗传学实验,模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定,1,二、实验目的,提取植物基因组DNA的方法PCR操作方法琼脂糖凝胶分离核酸方法,2,三、实验原理,1.Ti质粒和T-DNA：,Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。,3,将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。,4,2.T-DNA插入基因内部导致基因突变T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。,5,3.用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。,6,利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物BP是T-DNA区段上的引物,7,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：,8,扩增结果,经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（大带）；在杂和突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。,9,10,2*CTAB提取液(PH8.0)2%CTAB1.4MNaCl20MmEDTA(PH8.0)100MmTris-HCl(PH8.0)0.2%巯基乙醇CTAB提取液（1000ml）组成：20gCTAB100ml1MTris-HClpH8.040ml0.5MEDTApH8.081.8gNaCl0.2%(V/V)-巯基乙醇）,11,步骤,1.用液氮将100mg幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5ml离心管中加入预热至65的600l的2CTAB提取液，轻摇混匀。2.65水浴30min，其间轻摇混匀。3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10min，12000rpm离心15min，再转移上清入新管。4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20下30min，12000rpm离心15min，弃上清。5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm稍离心，弃上清。6.将沉淀晾干，加20-50lTE(pH8.0)，65水浴30min溶解DNA。7.琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量。,12,PCR原理和方法,聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；,13,PCR标准反应体系,DNA模板引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶,14,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度加量过多导致非特异性扩增增加特异性长度适当、避免二级结构和二聚体完整性避免反复冻融浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则,引物,扩增产物太少,15,引物设计软件,PRIMERPREMIER5Oligo6,16,反应体系对PCR扩增的影响,反应Buffer,pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂,Mg2浓度,过高非特异性严重过低无扩增产物,dNTPMixture,浓度适当避免反复冻融,ddH2O,pH值适当避免污染,17,如何选择最合适的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性,纯度,稳定性,酶活性,18,反应体系,H2O10 xTaqbuffer（MgCl2free)MgCl2(25mM)引物LP(10uM)引物RP(10uM)引物BP(10uM)dNTP(各2.5mM)模板DNA(30-50ng/l)Taq酶(5U/l),19,反应体系（三引物体系）,25ul体系H2O15ul10 xTaqbuffer（MgCl2free)2.5ulMgCl2(25mM)2ul引物LP(10uM)1ul引物RP(10uM)1ul引物BP(10uM)1uldNTP(各2.5mM)0.5ul模板DNA(30-50ng/l)2ulTaq酶(5U/l)0.2ul,20,反应体系（双引物体系）,25ul体系H2O16ul10 xTaqbuffer（MgCl2free)2.5ulMgCl2(25mM)2ul引物LP或（引物BP）(10uM)1ul引物RP(10uM)1uldNTP(各2.5mM)0.5ul模板DNA(30-50ng/l)2ulTaq酶(5U/l)0.2ul,21,反应程序,预变性945min9440sec5350sec7280sec循环35次7210min,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤变性退火延伸,22,LPTCATCCACCATGGAAGAAAAGRPTTGGATACGATGCGAGTAACC中间引物BPTGGTTCACGTAGTGGGCCATCG用LP+RP产生大带：1107bp用LBa1+RP产生小带：560-860bp,23,琼脂糖凝胶电泳技术,DNA含有PO43-基团，在pH8.0Buffer中带负电,在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；,24,选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，