菊花组织培养和月季花药培养.ppt

课题1菊花的组织培养,通过必修课的学习，我们已经了解到大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？,组织培养,扦插,嫁接,压条,是指在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织、细胞和原生质体，并使其生长、增殖、分化以及再生植株的技术。,组织培养,（一）植物组织培养的基本过程,（1）基础知识,细胞离体,必要条件：,一定的营养物质、激素和其他外界条件,原理:,细胞的全能性,植物细胞具有全能性，即已分化的细胞，具有使后代细胞形成完整个体的潜能。,原理：,定义：,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因,细胞的分化,概念：,在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程,结果：,形成不同的细胞和组织,原因：,基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果,离体的植物器官、组织、细胞,脱分化,愈伤组织,再分化,根芽,植物体,植物组织培养的基本过程,愈伤组织,（二）影响植物组织培养的因素,1.不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。例如，烟草和胡萝卜的组织培养较为容易，而枸杞愈伤组织的芽诱导就比较难。因此，植物材料的选择直接关系到实验的成败。对于同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。,2.离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的一种培养基是MS培养基。其主要成分包括：大量元素，如N、P、K、Ca、Mg、S;微量元素，如B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co；有机物，如甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素，以及蔗糖等。在配制好的MS培养基中，常常需要添加植物激素。,与培养细菌的培养基有何不同？,MS固体培养基成分及比例,微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。,阅读课文，思考以下问题,1.同微生物培养基相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？,2、你认为组织培养过程中，成功的关键有哪些？这些步骤的适宜条件是什么？,组织的脱分化及愈伤组织的再分化。,植物组织培养过程中，影响植物细胞脱分化、再分化的最重要因素是植物激素，细胞分裂素与生长素之间的浓度比可以调控植株组培过程中芽和根的形成。,3.植物激素浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，会影响实验结果。,植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果。,当同时使用这两类激素时，两者用量的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高利于根的分化，抑制芽的形成生长素/细胞分裂素适中利于促进愈伤组织的形成低利于芽的分化，抑制根的形成,4.除了上述因素外，PH、温度、光照等条件也很重要。不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将PH值控制在5.8左右，温度控制在18-22，并且每日用日光灯照射12h。,生长素/细胞分裂素,高有利于根的分化、抑制芽的形成低有利于芽的分化、抑制根的形成,（一）制备MS固体培养基,（二）外植体消毒,（三）接种,（四）培养,（五）移栽,（六）栽培,二、实验操作,二、实验操作,（一）制备MS固体培养基,1、配置各种母液,2、配置培养基,3、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌,1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝,（二）外植体消毒,2、消毒,流水冲洗,菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右,酒精处理,用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70的酒精中摇动23次，持续67s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗,消毒液处理,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液,（三）接种,污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟,1、接种室消毒,2、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,（四）培养,接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒。培养温度控制在18-22，并且脱分化形成愈伤组织后，每日用日光灯光照12h。,（五）移栽,移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日,1、打开封口膜,2、清洗转移,用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间,（六）栽培,3、移栽,珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培,幼苗长壮后，移栽到土壤中,幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花,课堂2月季的花药培养,1、被子植物定义：凡是种子有果皮包被着，胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物,一、被子植物和裸子植物,2、裸子植物定义：凡是胚珠裸露，外面没有子房壁包被，种子外面没有果皮包被的植物称为裸子植物,实例：玉米、大豆、梨、杏,实例：松、杉、柏,3、花的结构,4、花的作用,被子植物的有性生殖是在花里进行的，雌蕊和雄蕊是进行有性生殖的主要部分,二、被子植物花粉粒的形成,1、雄蕊的结构,雄蕊：,2、花药的结构,花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞,3、被子植物的花粉发育,花粉粒的形成,经历时期：,四分体时期、单核期、双核期,两个精子和一个营养核的基因型相同,四、产生花粉植株的两条途径,五、影响花药培养的因素,1、材料的选择,接种的花药时期,选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素,因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。,选材是否成功是花药培养成功的关键,选材,最适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期,选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药。,花药培养时期的选择,其它时期选择的缺点,花药培养时间,为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。,选择完全未开放花蕾的原因,完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒,单核期花药的挑选,一般月季的花药培养时间选在五月初到五月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可能提高花粉的诱导成功率,月季花药培养时的花粉粒最好是（）A、四分体时期B、单核居中期C、单核靠边期D、二核或三核花粉粒,C,2、培养基：,花药培养基所采用的培养基可能因植物的不同而有所变化小麦中为N6，马铃薯、月季中为MS，油菜中为B5培养基,某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。,六、实验操作,（一）材料的选取,最常用的方法有醋酸洋红法,1、确定花粉发育时期方法：,醋酸洋红法染色机理,醋酸洋红为碱性染色剂，而花粉细胞内有染色体，染色体主要成分是DNA和蛋白质,易被碱性染料着色染成红色。,醋酸洋红的配置,2、醋酸洋红法,将花药放在载玻片上，加一滴质量分数1的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显微镜下检查。,染色操作,3、焙花青铬钒法,将无水酒精与冰醋酸按体积比为3：1的比例混匀,卡诺氏固定液的配制方法,作用：能迅速穿透细胞,将其固定并维持染色体结构的完整性,还要能够增强染色体的嗜碱性,达到优良染色效果。,花药应该在卡诺氏固定液中固定20min，然后取出放在载玻片上，加焙花青铬钒溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜下检查。,焙花青铬钒溶液的配制方法,染色操作,（二）材料的消毒,1、酒精处理,花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒，立即取出。无菌水清洗无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分,2、消毒液处理,（三）接种和培养,放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中24分钟（也可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）无菌水冲洗35次用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。,在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药,要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成,立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10个。,1、剥取花药,勿损伤花药，以免诱导出非花粉愈伤组织,2、接种,注意：,培养条件：温度控制在25左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。,3、培养,培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株,注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。,在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是营养核和生殖核融合造成的）,4、鉴定和筛选,5、植物组织培养技术与花药培养技术的异同点：,注意花药离体培养和单倍体育种的区别,选学,1、雌蕊的组成,柱头、花柱、子房,2、子房的结构,被