10看第十章.常用药用植物细胞的大量培养.ppt

第十章.常用药用植物细胞的大量培养,即人工控制条件下，高密度地大量培养植物细胞的技术。目前已有100多种植物分离出300多种效成分：人参（人参皂苷；强心剂），三角叶薯芋（薯芋皂苷；避孕）除虫菊（除虫菊酯；杀虫剂），甜叶菊（甜菊苷；无营养甜味剂），茉莉花（茉莉花油，香料）,第十章.常用药用植物细胞的大量培养,意义：1）不受地理、季节和气候条件的限制；2）节省土地，降低成本，生产周期短，可大大提高经济效益；3）可代替整体植株在工厂内连续生产所需产物；4）可通过添加抑制剂等使生物合成按照人的意志进行；5）可通过诱变筛选，获得高产细胞株，并且可以进行特定的生物转化获得新的有用物质。,第十章.常用药用植物细胞的大量培养,发展与成果例证1.1959年Tu1ecke和Nickell首次采用大体积20升的硫酸瓶进行了蔷薇(Rosasp)茎段的细胞大量培养。2.1967年Kaul和Staba采用多升发酵罐对小阿米(Ammivisnaga)进行了细胞大量培养的研究，并从细胞培养物中得到了第一个药用成分呋喃色酮(visnagin)。3.1972年，Kato培养烟草细胞以获得尼古丁，最后放大到在20000升的生物反应器上进行分批和连续培养，其生产能力为582kgm3d。,发展与成果例证,4.1983年，*三井石油化学工业公司利用大规模培养紫草细胞生产紫草宁，产物终浓度达1400mgL；随后，Ushiyama等在20000升生物反应器中成功地进行了100公斤月的人参愈伤组织培养。迄今为止，全世界已对近1000余种植物进行过细胞培养方面的研究，生产的天然产物包括药品、香料、色素、食品、化妆品等500多种。许多植物的细胞培养已完成实验室阶段研究，正向工厂中试过渡，有的已完成工厂化生产规模的实验。如人参、紫草、毛地黄、烟草、肉桂、迷迭香、黄芪等,第一节药用植物细胞大量培养方法,与微生物发酵相似，大致分三个阶段：高产细胞株的建立；扩大培养；生物反应器培养。,第一节药用植物细胞大量培养方法,一、高产细胞株的建立：1.细胞株来源：外植体愈伤组织继代、松散愈伤组织三角锥瓶液体培养摇床振荡培养悬浮培养物中分离。2细胞无性系的建立细胞克隆技术平板培养技术：将细胞分散程度好，生长迅速的细胞悬浮培养液通过双重不锈钢网除去细胞集聚体，滤液接于琼脂最佳培养基；培养得到起源于单细胞的菌落。3高产细胞株的选择即目的高产植株选择，需有较好的测试方法：产量测定和产物活性测定。,第一节药用植物细胞大量培养方法,二、扩大培养：即高产细胞株多次扩增。获得大量无性系细胞，提供反应器的接种材料，并作最佳培养条件的探讨：1培养基的最佳调节：前中后期碳、氮源，P、K、Ca、Fe等测定2培养条件的调节：温度、溶氧、转速、剪切力等,第一节药用植物细胞大量培养方法,3前体物：即合成目的物的前体物质。鸟氨酸，苯丙氨酸、酪氨酸，作为生物碱的前体。L苯丙氨酸紫草素3倍以上产量4胁迫：即植物抵御性（理、化、生物侵袭）物质产生，用针对性不良环境促使植物更多产生某一物质。如用真菌诱发因子（已灭菌的菌丝、培养物的粗滤液，蛋白质提取物）微诱导植物产生抗毒性物质。,第一节药用植物细胞大量培养方法,三生物反应器培养（一）.考虑几个因素：1.供氧能力；2.剪切力；3.细胞在反应器上的附着情况；4.细胞高浓度培养时的混合状况；5.温度、ph值及营养物质浓度；6.细胞团大小；7细胞放大培养的难易程度；8.维持无菌状态的性能,第一节药用植物细胞大量培养方法,（二）生物反应器类型1.机械搅拌式,第一节药用植物细胞大量培养方法,2.气动式,气体搅拌式反应器(a)鼓泡式反应器(b)内循环气升式(c)外循环气升式,3.机械搅拌及气动式组合,第一节药用植物细胞大量培养方法,（三）培养方式1.悬浮培养反应器：要求：合适的氧传递、良好的流动特性和剪切力低,第一节药用植物细胞大量培养方法,2.固定化培养优点：稳定性好、不容易聚集成团、产物容易分离纯化、利于连续化生产（1）流化床反应器培养通过培养液和无菌空气使细胞团或者固定化植物细胞处于悬浮状态.剪切力大，容易破坏细胞（2）填充床反应器培养使细胞团或者固定化植物细胞堆叠在一起，固定不动，培养液流动通过并提供氧气和营养细胞与培养液混合效果差，传质效率低,第一节药用植物细胞大量培养方法,（3）膜反应器培养将植物细胞固定在一定孔径的多孔薄膜中传质效率低、易堵塞,固定化细胞生物反应器,第二节人参培养细胞工业化生产,1968年：日本明治制药公司，古谷1972年：德国也获成功我国80年代由此产生的“人参酒”有效成分：人参皂甙,第二节人参培养细胞工业化生产,工艺流程：一、建立高产细胞株：叶柄（消毒）MS+2.4-D0.5(25;暗培养)愈伤组织(克隆)细胞无性系紫外线诱变(固体培养)筛选高产细胞株(人参皂甙多)二、扩大培养：高产细胞株MS+2.4-D0.5液体培养（28，散光；摇床80-90转/分）3-5周后，继代,第二节人参培养细胞工业化生产,三、大罐培养：培养基Tulecde容量10升，温度26-27，散光搅动80-90转/分。前体物：法尼醇四、提取：培养5周后，皂甙，皂甙元。,丹参发根生物反应器大规模培养技术,药用植物发根大规模培养的关键在于：其生物反应器培养技术.发根培养已在搅拌、气升、喷淋床、雾化等形式的生物反应器中进行。由于发根是分化程度较高的器官,具有一定的形态结构,因此它的培养与悬浮细胞培养属于不同发根培养研究。,丹参发根生物反应器大规模培养技术,用植物组织培养反应器(10升规模)进行了丹参发根培养的研究,发现丹参发根在50天内鲜重增殖倍数可高达240倍