[新城疫病毒TS09耐热株HＮ基因的序列测定与分析]基因七型新城疫

新城疫病毒TS09耐热株H基因的序列测定与分析基因七型新城疫 摘要：新城疫病毒耐热株是由株经耐热选育得到的新毒株。对其血凝素神经氨酸酶（，）基因进行序列测定分析。选取B中国内外具有代表性的序列与其进行同源性和系统进化分析。结果表明，氨基酸序列同源性比较中，耐热株与株的氨基酸的同源性为；在核苷酸系统进化树中，株位于基因型的分支上，耐热株位于基因型的分支上；耐热株中基因中含量为，比不耐热株含量高；但比较耐热株和不耐热株蛋白的螺旋，耐热株比不耐热株的蛋白在跨膜区和胞外区均多出一个长的螺旋。同源性和系统进化分析表明耐热株与株有很近的亲缘关系；耐热株和不耐热株蛋白的含量、螺旋有很大的差别，这可能与耐热性有一定的关系。 关键词：新城疫病毒；耐热株；基因；序列测定；耐热分析 ：0439114（11）122543-03 G H S ， ， ， ， ， ， （ ， ， ， ； ， s， ， ） ： - （） D B were selected ze ， ， ， h thermolabile ， representate ： ； ； ； ； 新城疫（ ，）是由新城疫病毒（ ，）引起的禽类急性烈性传染性疾病，每年给国内外的养殖业带来了巨大的经济损失。属于副黏病毒科腮腺炎病毒属，其基因组有 、 和 个核苷酸三种长度，有六个大的开放阅读框，编码个主要蛋白（即核蛋白，磷蛋白，基质蛋白，融合蛋白，血凝素神经氨酸酶和聚合酶）。蛋白和蛋白是的两种囊膜糖蛋白，它们与的致病性和免疫原性密切相关。蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，在侵染宿主细胞的过程中，蛋白能识别、吸附受体，并且能促进蛋白与胞膜的融合。在不同的毒株中，基因的长度大小不一，其长度范围在 ，编码的蛋白质长度也随之变化。 新城疫在我国属于强制性免疫疫病。目前，市场上使用的疫苗有活疫苗和灭活疫苗两种，活疫苗包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗。这些疫苗各有缺点：中等毒力株活疫苗有较强的毒副反应，且有出现毒力返强的风险；低毒力活疫苗冷藏条件要求高，常因保存或使用不当而影响疫苗免疫效果；灭活疫苗需要肌肉注射，费工费时，免疫成本高，且影响禽肉品质。因此，研制无毒耐热活疫苗在防控新城疫方面有很重要的意义。 株是澳大利亚学者从周龄有溃疡的鸡腺胃中分离的株自然无毒耐热毒株，年，我国从澳大利亚引进该毒株，并对其部分生物学特性进行了研究，结果表明引进的株免疫鸡群后，抗体水平十分不一致，因而影响免疫鸡群的保护率。随后国内一些学者结合我国的实际进行了多方面的研究，并培育筛选出新的克隆株。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所于年引入该株，并对其进行了耐热选育，获得了株新的耐热疫苗株株。经耐热试验分析（数据未列出），该毒株的耐热性比亲本株更好，且其保持原有的无毒力。该研究对耐热株的基因进行了序列测定，分析了其与株的进化关系，并从蛋白一级结构与耐热性的关系角度探讨了其可能的耐热机制，为寻找耐热株的耐热因子提供理论依据。 材料与方法 毒株 耐热株由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所对 株经耐热选育后获得，为鸡胚尿囊液，鸡胚半数感染剂量（）为。 试剂 主要仪器和试剂： 仪、 电泳仪购自公司； 、琼脂糖购自公司；裂解液购自公司；、酶、反转录酶和随机引物购自上海宝生物公司； （）购自上海华舜生物技术有限公司；氯仿等试剂为分析纯试剂。 引物设计 参考上与 株基因相似度最高的序列（序列号为），设计了两对引物。两条扩增片段之间有 的重叠区，覆盖了整个基因区域以及其上游下游部分序列。两对引物的序列为： ： ： ： ： 由上海博尚生物有限公司合成。 病毒提取及合成 根据提取试剂盒说明书提取病毒全基因组。病毒样品用 的水溶解。取 样品和 随机引物在 水浴 ，立即冰浴；加入 ， ， ，混匀后 ； ；冰浴，待进行扩增。 扩增及产物纯化 取 作为模板进行基因的扩增。体系为： （含）， ， 上游引物， 下游引物， 模板， 酶， ；反应条件为： ； ， ， ，个循环； 。产物以琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后，切下目的片段，用 纯化回收。 序列测定与分析 纯化的扩增产物送上海生工生物技术有限公司进行序列测定。对株以及由（美国国家生物信息数据库，）检索获得到的株 基因序列（其具体信息见表）进行同源性和遗传进化分析。氨基酸同源性分析采用软件包中的程序。遗传进化分析采用软件（ ，版本），具体参数设置参照文献进行。 结果 耐热株基因的扩增 分别以引物对（；）、（；）扩增出号和号片段，琼脂糖凝胶电泳结果见图，由图可得，两条目的条带均在 左右，与预期的大小（号 和号 ）相符。 耐热株基因序列测定 对产物进行纯化及序列测定后，将两条序列进行拼接，获得 株基因的全长序列。该基因全长为 ，编码由个氨基酸残基组成的多肽。推导的蛋白质分子量为 ，等电点为。 耐热株基因的氨基酸同源性分析 应用软件包中的程序，对包括耐热株在内的株 基因进行氨基酸同源性分析。结果表明，耐热株与其余株 蛋白的氨基酸同源性为。株与、株的同源性最高，均为；与株的同源性为。 基于基因的遗传进化分析 应用软件，对包括耐热株在内的株 基因进行遗传进化分析，得到图。由图可得，个毒株依据其亲缘关系的远近，可分为个基因型。毒株的基因分型结果与表中所描述的分型结果一致，表明进化树构建成功。分析耐热株与其亲本株的亲缘关系：株属于基因型，而耐热株则位于基因型的单独一个分支上，与、等型代表株亲缘关系较远。结果表明，经过长期耐热选育，耐热株已经由原有的基因型进化为基因型。 耐热株基因以及蛋白质螺旋分析 比较株耐热株（、 和）和株非耐热毒株（、和）基因含量和疏水性氨基酸含量，结果显示耐热毒株含量明显比不耐热毒株高（表）。 比较上述株毒株的蛋白螺旋时发现，耐热毒株蛋白在跨膜区域里面有一个较长的螺旋（位置大约在氨基酸），而不耐热株没有或很短；耐热株蛋白在胞外区（氨基酸区）有一个大的螺旋（株除外），而不耐热株在这个区域只有一个或两个较小的螺旋（图）。 讨论 蛋白是一种跨膜蛋白，蛋白的主要疏水区在端，氨基酸残基为囊膜内区，氨基酸残基是跨膜区，其余为膜外区。耐热株与其他株蛋白氨基酸序列同源性为，与、和株同源性较高（达以上），这在一定程度上表明耐热株与、和株有一定的亲缘关系。有研究表明，蛋白的差异主要集中在氨基酸上，位以后变异相对较少，因此前位氨基酸的相似性可以很大程度上说明毒株之间的亲缘关系。在比较耐热株蛋白前个氨基酸与其他毒株的相似性时发现，株蛋白前个氨基酸与株蛋白前个氨基酸的相似性达到（其他数据未列出）。这进一步证实了耐热株与株具有较近的亲缘关系。在基于基因的遗传进化分析中，由株选育得来的株和耐热株位于同一分支上（型），而株却在型的分支上。由此表明，在耐热选育的过程中，蛋白存在一定程度的变异，其基因型也随之发生由型到型的改变。在型的分支中耐热株有单独在一分支上，而和、株位于另一分支上。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 耐热株基因长 ，编码个氨基酸，而株基因长 ，编码个氨基酸。比对发现，缺失的长度全部在蛋白的末端，也就是膜外区的末端。这可能是由于选育压力导致的，蛋白暴露在膜外的部分较大，末端的部分缺失可以减小蛋白在膜外的体积，使其结构更趋稳定，这大概是耐热株比株耐热性更好的原因。有学者认为蛋白对耐热没有太大作用，但我们的耐热试验结果表明，耐热株和株在水浴中温育 后，依旧具有一定的血凝活性，而对照株则完全丧失血凝活性，表明耐热株和株蛋白具有耐热性。 研究表明部分疏水性氨基酸随含量增加而增加，疏水性氨基酸的增加可以增加蛋白质的结构紧密性，从而使蛋白质结构更趋向稳定。比较耐热株和非耐热株时发现前者含量显著高于后者，但统计数据得到疏水性氨基酸含量并不与含量呈正相关。可见，蛋白的耐热性增加并不依赖于疏水性氨基酸的增加，含量的增加，可能是通过其他途径增加的耐热性。在分析蛋白中的螺旋时发现，耐热株普遍比不耐热株多两个长的螺旋，其中一个在跨膜区，这可能促进跨膜区蛋白质的稳定，有利于蛋白镶嵌在膜上，从而促进耐热；另一个在胞外区，这可以促进胞外区的蛋白的稳定，有利于维护蛋白的空间构象，保护功能区不受破坏，从而增加了蛋白的耐热能力。 综上所述，由氨基酸同源性分析可知耐热株与亲本株又很近的亲缘关系，但进化树分析表明两株之间存在一定的变异。蛋白质二级结构分析结果表明，发现耐热株和非耐热株蛋白螺旋存在一定的差异，这可能是蛋白耐热的部分因素。但病毒的耐热的机制是很复杂的，不但与核酸和蛋白质的组成以及蛋白质的二级结构和三级结构有关，还与蛋白质与蛋白质之间的相互作用等因素有关。该研究的后期工作是对 耐热株的全基因组进行测定，从全基因组的角度分析耐热毒株和不耐热毒株之间的差异，进一步推动病毒耐热机制的研究。 _： ， ， ， （ ） ，：- ， ， ， ： ， ，： - 黄勇，万洪全，刘红旗，等 鹅源新城疫病毒 株全基因组的序列测定 病毒学报，（）： 仇旭升，孙庆，姚春峰，等 两株基因型强毒新城疫的全基因组测序及其与系苗的关系 微生物学报，（）： 邵华斌，杨峻，熊忠良，等 鸡新城疫克隆株疫苗研究与应用 克隆株株选育及生物学特性测定 湖北农业科学，（）： 邵华斌，黎秋华，杨峻 鸡新城疫病毒株生物学特性的研究对鸽和鹌鹑的免疫性试验 湖北畜牧兽医，（）： 黎秋华，邵华斌，杨峻 鸡新城疫病毒株生物学特性研究（）对热的稳定性及在鸡群中的自然传播性试验 湖北畜牧兽医，（）