如何构建质粒克隆 教育学习

如何构建质粒克隆,周鸿雁2011.06.15,1,优选内容,目的基因,目的载体,Bax,pCMV-Sport6,EcoR,Bgl,连接Bax基因至EGFP载体思路,加入EcoR酶切位点,加入Bgl酶切位点,连接酶切目的基因两侧加入酶切位点,2,优选内容,MCS多克隆位点,Bax,pCMV-Sport6,缺点：无荧光：GFP、Dsred无标签:Flag、HA、Myc,3,优选内容,pCMVSPORT6MCS,Gene：BAXMGC:20956,IMAGE:4578562Insertsite：EcoRI,XhoI,4,优选内容,构建过程,设计引物(增加酶切位点,Bgl,EcoR)目的基因PCR双酶切载体(Bgl,EcoR)琼脂糖凝胶电泳DNA胶回收(基因,载体)双酶切目的基因(Bgl,EcoR)目的基因与载体相连DH5转化鉴定,5,优选内容,第一步：设计目的基因PCR引物目的：1）通过PCR方法扩增目的基因2）在目的基因片断两端增加酶加位点,酶切位点旁需加入保护碱基,6,优选内容,设计引物前需解决的问题,1、选择酶切位点2、选择保护碱基3、终止密码子,7,优选内容,PEGFPMCS,选择酶切插入位点：1、两个酶切位点间隔远2、目的基因序列中无相应酶切位点3、酶切缓冲液一致,8,优选内容,BAXinsertsequence,atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgattgccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctga,9,优选内容,*,*,DNAStar软件-MapDraw功能,10,优选内容,AGATCT-Bglbuffer3GAATTC-EcoRIbuffer3,AGATCT目的基因CTTAAG,AGATCT-目的基因-CTTAAG,PCR产物,产物酶切效率低、不准确！,11,优选内容,酶切位点保护碱基,protectionseqence:GGAAGATCTTCC2h=25%,20h90%CCGGAATTCCGG2h90%,20h90%,切割率,提高酶切活性、增加酶切效率、缩短酶切时间,保护碱基:限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响,12,优选内容,设计引物原则,引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，引物序列的GC含量一般为40-60%2.引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳3.避免引物二聚体及发夹结构4.引物的特异性5.碱基随机分布,13,优选内容,cggcggtgatggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggccPrimer1ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG(length-21,GC%-71.8%,Tm-71.4)ggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctgaggcccccagPrimer2TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG(length-25,GC%-52%,Tm-68.4),设计引物Primer5软件,14,优选内容,引物中是否应包含终止密码子？,MCS在EGFP之后表达，需加终止密码子,MCS在DsRed之前表达，不可以加终止密码子,15,优选内容,加入保护碱基及酶切位点,Primer1GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAGPrimer2CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG,16,优选内容,MCS与荧光相连的地方应特别注意有无移码,调整开放阅读框（ORF）,17,优选内容,荧光表达在前时(EGFP),Primer1GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAGPrimer2CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG因TGA为终止密码子，所以之后的移码不需理会,18,优选内容,荧光表达在后时(DsRed),Primer1CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtcPrimer2CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg,19,优选内容,荧光表达在后时需加KOZAK序列,Primer1CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtcPrimer2CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccggKOZAK序列:gccacc,加在起始密码子之前,20,优选内容,Primerfinal,Primer1GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAGPrimer2CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG,21,优选内容,33.5uLdH2O10uLphusionHFbuffer1uLdNTP(10mM)2.5uLprimerforward/reward1uLBAX1.5ulDMSO0.5uLphusionpolymerase50uL,1.98(1min)2.98(5s)3.65(20s)4.72(20s)5.backtostep2for25times6.72(10min)7.18forever,第二步：PCR目的基因,Phusion超保真PCR试剂盒,22,优选内容,Buffer3:2ulvector:4ul100%BSA:0.2ulEcoR:1ulBgl:2ulddH2O:10.8ul,374h,EcoR,Bgl,第三步：双酶切载体,20ul,23,优选内容,第四步：琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收,0.6%gel6*loadingbuffer50ulsample80V,目的基因,5kb2.5kb,载体,24,优选内容,Buffer3:2ulBAX:15ul100%BSA:0.2ulEcoR:0.5ulBgl:1ulddH2O:1.3ul,374h,第五步：双酶切及回收目的基因,20ul,TAKARA片断回收试剂盒,25,优选内容,第六步：回收效率验证,5kb2.5kb,Loadingvolume:5ul,Fromlefttoright:Marker:15000bpEGFPBAXrestrictionBAXPCRMarker:100bp,26,优选内容,T4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax:3ulvector:1ulddH2O:13ul,T4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax:6ulvector:1ulddH2O:10ul,T4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax:10ulvector:1ulddH2O:6ul,(1)(2)(3),16过夜,第六步：连接,载体100ng:,100 x目的基因分子量,载体分子量,X4/110/1,目的基因的量为:,27,优选内容,第七步：转化,100ulDH5+20ul连接产物,28,优选内容,第八步：验证(1),PCR,1-12,13-24,Positive:2,7,9,10,5.4uLdH2O2uLphusionHFbuffer0.2uLdNTP(10mM)0.5uLprimerforward0.5uLprimerreward1uL菌液稀释液0.3ulDMSO0.1uLphusionpolymerase10uL,29,优选内容,第八步：验证(2),双酶切(EcoR,Bg