流式细胞术基本原理详版 教育学习

流式细胞术基本原理,陈晓东产品技术专员,广州市珈源医学试剂有限公司,流式细胞术,流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,2,流式细胞仪的特点,单个细胞/生物颗粒分析同时多参数、多荧光分析高通量检测/高速度10000个细胞/秒以上定性/定量分析分选特定性状或功能的细胞可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液,3,目前流式细胞仪可以检测的类别,细菌,浮游生物,DM：0.2m15m,单核细胞,中性粒细胞,淋巴细胞,红细胞,4,5,流式细胞仪的基本构造,激光发射器发出所需要的波长的激光,前向散射光检测器,侧向散射光检测器,光学滤镜,流动室与液流系统：将细胞单个压入流动室,信号收集与数据处理系统,光源与光学系统,6,流动室,7,当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。,光学滤片,8,光学滤片的种类,长通滤片（LP）：630LP短通滤片（SP）：550SP带通滤片（BP）:488/10,9,10,共有两类：散射信号与荧光信号前向角散射信号（FSC）反映细胞大小侧向角散射信号（SSC）反映细胞颗粒度荧光信号（FLSignals）（FL1、2、3）胞内、胞外染色情况,流式细胞仪可获取的信号种类,11,FSC和SSC,直方图,流式细胞仪显示图的种类,12,把前向散射光图和侧向散射光图的一维图像在二维图像上投影，便是我们平常所看到的流式图。所以横坐标表示的是细胞的直径大小；纵坐标表示的是细胞的复杂程度。两者相结合就能说明细胞种类,散点图,13,二维等高图和密度图,14,假三维图与三维图,15,流式细胞仪如何获取细胞信号？,FSCSSCFL,16,前向角信号（ForwardScatter，FSC）,17,前向角信号：细胞的大小,18,19,侧向角信号（SideScatter，SSC）,20,21,FL,22,23,FSC、SSC、FL,24,如何分离90角内的各种荧光信号？,25,荧光染料,吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波长的光波的物质,PI,488n,600nm,26,荧光染料种类,荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色PerCP488670免疫荧光红色PI488620DNA染色橙红ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红色APC633670免疫荧光红色DAPI359462DNA染色蓝色,27,荧光染料光谱特征,28,荧光分离原则,在流式细胞仪中，一般经过LP或SP滤片将荧光大致分开后，再经过一BP滤片分离出特征荧光,29,开放式光路Calibur、Influx,流式细胞仪的光路,30,封闭式光路（Canto、LSR系列、Aria系列）,31,分选,将目标细胞分离并富集，进行后续研究。分选纯度99%,32,震荡,33,偏转板,34,几个概念,信号放大模式信号类型CV值样本流速激光延迟液滴延迟荧光补偿阈值门对照,35,信号放大PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变,光信号,光电倍增管（PMT）,放大器,电信号,放大器两种放大方式：线性放大（lin）对数放大（log）,36,线性放大（lin）,按光强度的线性关系输出信号.适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物过程的信号，如DNA含量、总蛋白含量等。,37,对数放大（log）,按光强度的对数关系输出信号.在免疫学测量中通常使用对数放大。,38,电脉冲信号类型,将与电脉冲信号强弱相关的电压数字化有三类电脉冲信号高度信号H面积信号A宽度信号W,39,CV值,CV值（变异系数）：样品均一度及仪器分辨率的标志,CV值一般2%,40,样本流速,41,高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。,样本流速选择,42,激光延迟（laserdelay）,Laser1,Laser2,43,液滴延迟（dropdelay）,44,颜色补偿,采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。,45,FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会进入PE检测器。如果单染FITC，同时打开PE检测器，则如图：,46,阈值,信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。,屏蔽噪音信号和碎片信号,47,门（Gate）,分析/分选感兴趣的细胞群,48,对照,同型对照：为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2，用于检测和消除（一抗）非特异性结合到组织细胞而产生的背景染色。空白