遗传学：朱军第三版：基因工程和基因组学 教育学习

第九章基因工程和基因组学P215,遗传工程或基因工程，是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动、植物新品种，工业化生产生物产品，诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。本章介绍遗传工程的基本原理和方法，基因组学的发展及应用前景。,第一节基因工程P215第二节基因组学P236,一、遗传工程概述P215*A、染色体工程*B、细胞工程*C、基因工程限制性内切酶P216载体P218四、基因的分离与鉴定P223五、基因工程的应用P230,一、遗传工程概述,遗传工程(geneticengineering)是七十年代才开始发展起来的一门新技术。它是在分子遗传学的理论基础上，综合采用分子生物学与微生物学的现代方法和手段建立起来的。这一先进技术的兴起，标志着现代遗传学已发展到定向控制遗传性状的新阶段。,一、遗传工程概述,遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，探索遗传与变异的原因及其物质基础。在此基础上：解释、研究生物进化的原因、过程和规律(遗传与进化)。改善动、植物和微生物的遗传特性按照人类的意愿，创造、培育各种生物的新类型、新品种的人工进化过程(育种学)。育种工作的理论和技术水平在很大程度上取决于遗传学所取得的成就。讫今为止，动、植物育种的绝大部分成就都是以经典遗传、细胞遗传和数量遗传理论为基础所取得的。六、七十年代的绿色革命；育种工作面临的问题。,一、遗传工程概述,(一)、遗传工程的基础人类对自然改造的能力取决于对自然规律的认识水平。分子遗传、生物化学及分子生物学、细胞生物学的理论和技术发展使生物遗传操作的能力正在不断提高。遗传工程的理论与技术基础主要来自于：1.分子遗传学的理论；2.生物化学及分子生物学的成就；3.细胞生物学理论和技术。,(二)、遗传工程的含义,生物技术生物工程：遗传工程；蛋白质工程、酶工程；微生物工程；遗传工程：在分子遗传理论、技术的基础上，通过工程设计与施工方式，从细胞、分子水平改造生物遗传特性。,作为一个综合性的技术群体系，广义的遗传工程包含许多相关的组成部分，其主要的部分有三个：1.染色体工程；2.细胞工程；3.基因工程。狭义的遗传工程指的是基因工程。,(二)、遗传工程的含义,遗传工程或以分为狭义和广义的两种。广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程。习惯上所讲的遗传工程多指基因工程。基因工程是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。,(二)、遗传工程的含义,(二)、遗传工程的含义,一般说来，进行基因工程首先需要一个施工的设计蓝图，然后才能进行施工的操作。基因工程的施工程序大致分为四个步骤：为施工准备材料，即“目的”基因、载体和工具酶等。把目的基因与载体结合成重组DNA分子。把重组DNA分子引入受体细胞，建立分子无性繁系(Clone)或称克隆。从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞中正确表达。,重组DNA技术,(三)、基因的分离与合成,目的基因即在遗传工程中所需要的基因，它的来源不外乎分离自然的基因与人工合成基因。目前采用的方法主要有两种：鸟枪射击法和化学合成基因。1、利用鸟枪射击法(Shotgun)分离基因；用限制性核酸内切酶把一个DNA分子切成一个或略大于一个基因的片段，然后把全部片段一一与载体组成重组DNA分子，转化到大肠杆菌K12中去，进行纯系繁殖，使每个基因片段都繁殖到适于研究的数量，再进行分离鉴定，选择出所需要的基因。,(三)、基因的分离与合成,(三)、基因的分离与合成,2、基因的化学合成1970年考兰纳(Khorana，H.G)等采用有机化学的方法首次合成了转录成酵母丙氨酸tRNA的基因，为基因的合成开辟了一条新的道路。考兰纳先合成大量彼此互补的10-15个核苷酸单链片段，然后用连接酶将它们连接并配合成双链。,一、遗传工程概述,一、遗传工程概述,一、遗传工程概述,一、遗传工程概述,一、遗传工程概述,一、遗传工程概述,一、遗传工程概述,一、遗传工程概述,一、遗传工程概述P216,*A、染色体工程,染色体工程是物种间遗传转移的最传统的方式，也是目前广泛进入生产应用的遗传工程。其重要性因作物不同而异：对蕃茄而言，世界上任何具有商业价值的栽培品种都带有一个从野生种导入的抗枯萎病性状，其它六个野生种则是耐盐性、抗虫性等性状的来源。小麦许多抗白粉病基因和抗锈病基因都来源于其野生近缘物种。相反，蚕虫改良则完全是在栽培种(Viciafaba)内进行杂交选择。现在还不能从其它任何种导入基因到该作物中。,(一)、种间有性杂交,生殖隔离是物种形成的原因之一，也是染色体工程面临的第一个难题，获得种间有性杂种的难易直接影响外源基因导入栽培作物。对不同的作物而言，种间杂交障碍的机制可能截然不同，其表现阶段也各不相同。目前认为，种间杂交产生杂种的障碍可能表现在以下几个阶段：受精前柱头和花柱中的障碍；受精过程中的障碍；受精后胚与种子发育过程中的障碍。,受精前障碍与克服,障碍机制：物种间花粉管与雌蕊不亲和，在花粉管到达胚珠之前，停止伸长而不能受精。主要克服办法：主要是选择适当的授粉时期，采用正反杂交、蒙导授粉、植物生长调节剂等。另外，有明确试验证据表明，栽培物种和野生种内均存在可杂交性遗传变异，并受简单遗传控制。利用可杂交性基因，能提高种间杂交的效率。,受精过程的障碍与克服,被子植物受精过程属于双受精，对种间杂交受精过程的生殖生物学研究表明：种间杂交的失败往往是由于双受精之一失败引起的。讫今为止，人们对受精的控制机制知之甚少，所以这一领域明显是一个有风险，但又极可能富有成效的研究领域。,(四)、染色体工程中的现代技术,在传统远缘杂交的基础上采用的现代技术主要是：离体胚(子房)培养技术；植物染色体显带技术；染色体分子原位杂交技术等。染色体工程仍然是外源基因转移最有效、最接近实际应用的技术。,*B、细胞工程,细胞工程的主要技术和研究领域包括：细胞、原生质体的分离、培养；细胞、原生质体植株再生；体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用；以细胞、原生质体作为基因工程受体；细胞、原生质体融合、杂种细胞筛选、鉴定与应用。,(一)、细胞、原生质体植株再生,采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分实现，再生成新的生物个体。对植物而言，细胞和原生质体再生技术已经比较成熟。曾经是人们公认难题的禾本科植物原生质体再生在近二十多年来也已取得巨大进展。对动物而言，克隆羊“多利”的诞生表明：动物细胞(包括人体细胞)再生成为个体都是可能，其技术实现需要的仅仅是时间。,(二)、植物原生质体作为基因工程的受体,最初常用的转基因受体有叶圆片、幼胚、愈伤组织等植物组织器官。在这些组织、器官中：细胞壁的存在会增加操作的难度；产生细胞嵌合体现象，难以筛选转化子。因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，转化效率高、筛选方便。采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞，通过诱导再生获得杂种个体(双二倍体)，可避免有性杂交障碍。,(三)、细胞、原生质体融合,动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成功。当然动物细胞融合都局限于获得杂种细胞及其无性细胞系。可以预见：用杂种细胞核代替维尔穆特获得克隆羊所采用的乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。人与小鼠杂种细胞的无性细胞系曾在人类基因染色体定位研究上发挥重要的作用。植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的基础。获得杂种细胞及其再生植株后，即可进行物种间细胞核、染色体以及细胞器的转移。,*C、基因工程,基因工程是遗传工程，以至生物工程的核心内容和最前沿技术，最集中地体现了现代生物学理论和技术成就。限制性内切酶和载体是基因工程的众多理论与技术基础中最重要的基石。基因工程的基本步骤可以概括为：目的基因的获得(基因克隆)；目的基因与载体连接(重组DNA分子)；重组DNA分子导入受体；转化体的筛选、鉴定；基因表达与产物分离。,P216限制性内切(核酸)酶与DNA连接酶,细菌细胞内特异性降解外源(异源)核酸分子的核酸酶。其作用特点是：特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)；I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列；II类限制酶交错切割DNA双链，产生粘性单链末端。来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子。通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶。重组DNA技术是基因工程最核心的技术，贯穿于整个基因工程各个步骤中。,细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异源DNA分子进入细菌细胞后，在许多情况下遭到毁灭，这个过程称为限制(restrietion)。限制的能力来源于微生物的一种特殊的酶，称为限制性内切核酸酶。这是一种水解DNA的磷酸二脂酶，它是遗传工程上的一种极其重要的工具酶。限制性内切酶可分为两大群：第一群以EcoB，Ecok等为代表，分子量在约为300000。它作用时需要ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸等辅助因子，能切断双链，切割部位没有特异性。第二群以大肠杆菌的EcoR1与嗜血杆菌的Hind为代表，分子量比第一群小，约为20000100000，与底物作用时，只需要Mg2+存在。能切断双链，切割部位在DNA分子上有特定的碱基顺序，即切割部位具有特异性。因此，遗传工程多采用这一群。,限制性内切酶,eg：限制性内切酶EcoR：P216图9-1,P217识别序列：回纹对称序列(palindrome)，不同生物的DNA具有相同识别序列。,酶切方式：以交错方式切断DNA双链，产生二个相同的单链粘性末端。,重组过程：两种片段在适宜条件下，可经碱酸二脂链，连接成重组DNA分子。,限制性内切酶,限制性内切酶,限制性内切酶,限制性内切酶,第二群限制酶有两大特点：1、只在一定核苷酸顺序上起作用，在遗传工程上应用最多的是EcoR1，它所切断的部位如动画所示；另一个应用较多的是Hind它所切断的部位如动画所示。2、多数可以产生粘性末端，即在酶解时，DNA双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状DNA，如动画所示，因此称为粘性末端。,P217,P217,载体(vector)P218,用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆克隆载体；在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达转化载体或表达载体。,载体(vector)P218,载体(vector),载体(vector),载体(vector),作为载体，至少需要具备下列三个条件：1、在宿主细胞中能自我复制，并能稳定地保存。2、有多种限制酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因(genemarker)，并能嵌入外源DNA的片段。3、具有可作为重组DNA分子选择标记的遗传标记。目前只有少数的细菌质粒、噬菌体、类人猿病毒SV40符合上述的条件。,载体(vector),载体(vector),质粒是在细菌中发现的，它是易于取出和引入的小型环状DNA。一般有1200Kb左右(Kb为千碱基对)它的DNA分子很小，一般为细菌染色体DNA的0.53%。一个细菌细胞内质粒的数目可能有12个，有的可能有2060个。基因工程中最有意义的质粒有两类：一类是对多种药物以及重金属和紫外线有抗性的质粒；一类是携带有合成大肠杆菌素基因的质粒。大肠杆菌素是具有蛋白质性质的抗生素，它使大肠杆菌敏感株致死。,P219图9-4,载体(vector),噬菌体不易引起生物危害，而且用它作为载体DNA有助于进入细胞以及具有在细胞内易于繁殖的优点。噬菌体失去其DNA总量的25%，仍不失活，再多则失活。这一部分DNA的空挡正好用于转运其他DNA。除噬菌体外，用其他一些病毒也可以作为载体，特别是将外源DNA移入真核细胞并使之繁殖时，就必须找到一种能在真核细胞内增殖的基因载体，能使灵长类和啮齿类致癌的病毒SV40就符合这种要求。,P219图9-5,柯斯质粒(cosmid)是利用部分噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的(图95)。柯斯质粒具有噬菌体的cos序列(12bp)和细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因可接受长达50kb的外源DNA片段，这在克隆真核生物基因中十分有用，因为一个DNA片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。还与YAC克隆系统结合，用于基因作图分析。,P220,P220图9-6穿梭质粒YEP24,P220,P221,P221,P220,P220,P222,(一)、目的基因的获得,基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特定的基因进行操作。因此分离目的基因并获得足够的拷贝数(基因克隆)是基因工程及相关研究工作的前提。1.基因库构建与目的基因分离；2.PCR扩增、克隆基因；3.化学法合成基因。获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、结构分析、表达机制以及表达机制研究。,克隆(clone)的含义,名词(pl.clones)：克隆、无性(繁殖)系。生物个体、细胞的无性繁殖系；同一基因或DNA片段的多份拷贝。动词(cloning)：克隆。细胞克隆：从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的细胞；分子克隆：获得单个基因/DNA片段多份拷贝。常用的方法有：将带有目的片段的重组DNA分子导入到特定宿主细胞中，利宿主细胞DNA复制系统进行复制；利用DNA聚合酶在无细胞系统中复制(PCR,聚合酶链式反应)。,基因库构建与目的基因分离,基因库(基因文库)：包含特定基因组所有基因、DNA区段的全部分子克隆的集合体。根据分子克隆中所含核酸片段的类型，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库和线粒体库等。构建基因库的基本过程以及从基因库中筛选含目的基因克隆(亚克隆)的方法教材上有简要的描述，本课程仅作为初步了解。分子克隆实验指南(分子生物学与基因工程研究作者的圣经)中译本有一千多页。,(二)、转基因受体,转基因受体的种类和特性对目的基因导入、导入后筛选、受体的再生等都有很大的影响。植物基因工程常用受体包括：组织、器官、悬浮培养细胞、未成熟胚、合子以及原生质体等。可分别通过器官发生、胚状体或直接发育而获得转基因植株。动物基因工程受体主要有两类。一类是受精卵或早期胚胎。可以发育形成动物个体(转基因动物)。许多研究发现转基因动物获得的性状可以稳定的遗传，表明外源基因可以整合到受体的染色体上。另一类受体是体细胞无性系。在“多利”诞生之前，这类受体仅局限于获得转基因细胞系供基因表达等的研究，也可用于药物生产。,(三)、目的基因导入受体,将目的基因导入受体，并整合到受体染色体上是基因工程目标实现的关键环节。在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源基因导入受体的过程称为转化(transforming)，将接受外源基因并整合到染色体上的细胞、个体称为转化体/转化子(transformant或transgenic)。最常用转化方法是：载体导入；理化方法导入(微注射、基因枪、电穿孔法、化学法)；还有一种特殊的方法是将外源总DNA导入植物。,1.载体法导入外源基因,载体法：将目的基因连接到特定的载体(转化载体)上，利用载体进入细胞并整合到受体染色体上的能力实现外源基因转化。Ti质粒及其衍生载体是最常用的植物基因工程转化载体，具有导入外源基因并整合到染色体上的能力。将目的基因与载体连接的过程就是重组DNA分子构建的过程(如前述)。将含有转化载体(重组DNA分子)的根癌农杆菌与受体共培养就可以实现转化。,2.理化方法导入外源基因,理化方法是采用物理、化学方法使受体细胞膜产生局部破损或缺陷，被动吸纳外源DNA片段。(1)微注射/显微注射：在显微镜下用注射器将DNA片段注入受体细胞(动物受精卵)。针头是0.5-10m尖头玻璃管。(2)基因枪：将DNA片段(载体?)包在钨或金微粒表面(1-3m)，用静电或火药爆炸等驱动微粒射入受体。(3)电穿孔法：将受体细胞置于脉冲电场中，可以使细胞膜产生短暂的(30nm)左右的微孔，吸收DNA片段。(4)化学法：许多化学物质，如PEG(聚乙二醇)可以刺激原生质体产生吸收DNA片段。常用PEG与电穿孔法结合，提高外源DNA的吸收率。,3.外源总DNA导入植物,基因工程技术“本土化”过程中，国内生物科技工作者受基因工程在从分子水平进行基因转移的启发，设计了一些外源DNA导入植物的方法。这里介绍的两种方法均是采用供体植物的全部DNA提取物作为操作材料，省去了目的基因获得的过程，所以称为外源总DNA导入。(1)减压渗透法(刘熔山)；(2)花粉管通道导入法(周光宇)。,*(四)、转化体的筛选与鉴定,转化体筛选：根据转基因技术设计进行，如：载体上带有特异性状标记，特别是某种抗生素抗性等。转化体鉴定有两个层次：目的基因是否进入受体(可以是大肠杆菌、酵母、植物或动物)，得到转化体。即在DNA水平进行筛选与鉴定，常用方法有：限制性酶谱分析、核酸分子杂交、核酸序列测定、序列分析、RFLP等一切可鉴定特定DNA片段的方法。目的基因是否能够正常表达。包括性状表现、蛋白质产物鉴定。,四、基因的分离与鉴定,(一)从基因库中分离基因(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因(三)人工合成基因,P224散弹枪法构建基因文库,核基因库通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体(如EMBL)连接构成重组DNA分子,根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体或cosmid，BAC或YAC等。,理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目少，因此，构建核基因库时常要选择能接受较大片段的载体。检测构建的核基因库是否包括一个完整的基因组序列，可用下面的公式计算：例如人类基因组DNA分子量为3.0 x106kb,以EMBL作载体，插入片段的平均长度为17kb，p为99%时构建的基因库应有8.1x105个重组噬菌体。,流式细胞分离原理分离染色体进行涂色验证,P225图9-10,开始合成cDNA,cDNA-RNA杂合双链,cDNA3发夹结构,合成第二链,双链cDNA,P225,将经重组噬菌体(来自构建的基因库)感染的宿主细菌细胞与少量上层培养基混合培养，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。再将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，然后用标记的探针(也变性成单链)与膜上的噬菌体DNA杂交，杂交膜用X-光片放射自显影，检测杂交信号。凡是与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆。根据杂交信号在膜上的相对位置，定位找出培养皿中所对应的噬菌斑，挑出、培养阳性噬菌斑，制备DNA，用作进一步分析。,菌斑杂交法筛选噬菌体核基因库,P226,P227图9-12,结果分析从凝胶电泳结果可见，用Not酶切产生二条带，用Sal酶切也产生二条带。根据模式预计的三个片段长度与实验结果一致，因此模式就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。,P225,采用类似的方法，可将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。此外，上述经Not或Sal消化的片段，可以亚克隆到pUC18等质粒上，进一步用于限制性图谱分析或序列测定。,将DNA用限制性酶酶切酶切DNA电泳变性转移到膜上经过标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交洗去膜上非特异性结合的探针检测杂交信号。如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。在筛选基因库得到阳性克隆后，往往是将限制性酶酶切与Southern杂交结合起来，绘制限制性酶图谱。SOUTHERN.EXE,核酸分子杂交Southern杂交(Southernblotting),P228,P228,在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：,DNA自动测序：同Sanger法，不同的是用4种不同的荧光染料标记引物，分别对应4种双脱氧核苷酸，把4种反应物混合后，走聚丙烯酰胺凝胶电泳，激光照射，荧光检测器。全自动激光荧光核酸顺序及片段分析系统,P228,目的基因与载体连接(DNA分子重组),DNA分子重组,目的基因导入受体,转基因的方法和技术,农杆菌转化法,通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到染色体上的方法。这种转化方法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。基因枪技术还用于转化微生物、动物细胞、动植物器官、细胞器和正在生长的植物。另外，基因枪在多基因共转化中更表现出极大的优越性。,Wilmut等，Nature385,1997,受精卵细胞注射法转基因牛：受精卵注射法,左：转移有人类生长激素转基因鼠右：同胞鼠对照,人类生长激素转基因猪,与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢一些。例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。人类抗胰蛋白酶基因缺失导致的肺气肿，属于一种先天性遗传疾病。将人的抗胰蛋白酶-1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊体内，产下的转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶(35g/L)，这一结果说明可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。,P233BamHI酶切位点,P234图9-21,P234,P234图9-22,P234,P235图9-23,P236图9-24,基因不表达,基因表达,第二节基因组学P236,人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)：1996年，构建了每个标记的密度为0.6Mb(1Mb=一百万个碱基)的人类基因组遗传图谱，0.1Mb的物理图谱。2000年完成了人类基因组草图的构建，并已测定基因组的大量核苷酸序列。水稻基因组计划(ricegenomeproject，RGP)模式生物，如：酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟南芥基因组计划,9-2,P238,(2)DNA标记,以DNA为基础的分子标记主要包括（Gupataetal，1999）基于杂交的分子标记，如RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism）。基于PCR的分子标记，如RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA）、AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism）、SSR(simplesequencerepeats；又称microsatellite)、AFLP(Ampliconfragmentlengthpolymorphism)等。基于DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（singlenucleotidepolymorphism）。,RFLPRFLP技术是基于Southern杂交的分子标记的方法。它是指用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，酶切片段长度的差异。这一技术用放射性同位素标记DNA片段作为同源序列探针（RFLP标记），与经限制酶消化并转移到支持膜上的基因组总DNA杂交，通过放射性自显影（或非同位素技术）来显示酶切片段的大小，检测不同遗传位点的多态性,RAPDRAPD由Williams等（1990）和Welsh等（1990）分别发展起来的分子标记技术。这一技术是以基因组DNA为模板，采用随机设计的单个寡核甘酸序列（一般为10bp）为引物，通过PCR扩增，产生不连续的DNA产物，用于检测DNA序列的多态性。,SSR或微卫星重复序列：串联重复序列（tandemrepeatedsequence），其重复单位首尾相连，成串排列（Flavell1986）。散布重复序列（interspersedrepeatedsequence），其重复单位与其它无关序列或单拷贝序列相间排列。微卫星DNA序列又称简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）、短串联重复序列（shortsequencerepeat，STR），它是由几个核甘酸（一般15个）为重复单位簇集而成的串联重复序列，可分布在整个基因组的不同位置上，而且在基因组中的分布是随机的。微卫星长度具有高度变异性，并且这种多态性常常表现复等位性，两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，因而可以根据两端的序列设计一对特异引物，扩增每个位点的微卫星序列，从而揭示其长度的多态性（simplesequencelengthpolymorphism，SSLP）。,ISSRISSR是一种新型的分子标记。与SSR相反，直接用同位素标记SSR序列，扩增2个SSR间的单拷贝序列。为了增加扩增的特异性，在引物的5和3端分别加入12个选择性碱基，引物长度1618bp。,AFLPAFLP是由荷兰KeyGene公司Zabeau（1992）发现，并由Vos等（1995）发展起来的分子标记技术，结合了RFLP和RAPD技术的优点。AFLP的基本原理是基于PCR的扩增基因组DNA限制性片段多态性。基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头（adapter）连接到DNA片段的