第一章 蛋白质化学2

二、蛋白质的空间结构,蛋白质三维结构,二级结构,三级结构,四级结构,超二级结构和结构域,（一）蛋白质的构象1.构型和构象,构型：在具有相同结构式的立体异构体中取代基团在空间的相对取向，不同的构型如果没有共价键的破裂是不能互变的构象：取代基团当单键旋转时形成的不同立体结构，构象形态间的改变不涉及共价键的破裂如：乙烷分子的交叉型构象和重叠型构象,2.多肽主链折叠的空间限制,理论上，一条多肽主链有无限种构象蛋白质的天然构象：蛋白质在生物体内存在的具有生物学功能的一种或少数几种稳定构象由于肽键的部分双键性质，使天然蛋白质主链上的单键不能自由旋转,（1）二面角(用以表示多肽链的构象)与C-N键相连的C-Ca和N-Ca之间是单键，可以自由旋转，其旋转角分别为和多肽链所有可能的构象都能用这两个角来描述，称为二面角,完全伸展的多肽主链构象,-碳原子,酰胺平面,=1800，=1800,=00，=00的多肽主链构象,酰胺平面,=00，=00,侧链,非键合原子接触半径,（2）多肽链折叠的空间限制,一个多肽主链不可能有无限多种构象原子基团之间不利的空间相互作用肽单位有反式构象和顺式构象侧链基团的相互干扰使得反式构象更稳定脯氨酸残基多处于顺式构象中,（二）蛋白质分子内部的作用力,肽键、二硫键一级结构氢键、疏水作用、范德华力、离子键、二硫键三维结构,（）氢键(Hydrogenbond),两负电性原子对氢原子的静电引力所形成XHY质子给予体X-H和质子接受体Y间相互作用氢键具有：方向性-（键角）指XH与HY间的夹角饱和性-XH只与一个Y结合,氢键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力可以在侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链、主链肽基与水、主链肽基之间形成-螺旋、-折叠就是通过多肽主链上的羧基氧与酰胺氢之间的氢键来稳定的,（）范德华力(vanderWaalsforce),作用力较弱，随非共价键合原子或分子间距离的6次方的倒数而变化,只有当非共价键合原子或分子间处于适当的距离（范德华距离，即两个原子的范德华半径之和）时，范德华引力才能达到最大单个范德华力作用力很弱，但其相互作用数量大，因而也不可忽视,（）疏水作用(HydrophobicInteraction),球状蛋白质在水介质中将疏水残基埋藏在分子内部的现象称为疏水作用非极性侧链为避开极性溶剂水彼此靠近所产生主要存在蛋白质的内部结构蛋白质表面通常具有极性链或区域蛋白质可形成分子内疏水链/腔/缝隙稳定生物大分子的高级结构,（）离子键(ionicbond),又称盐键：具有相反电荷的两个基团间的静电相互作用,F：吸引力Q1/2：电荷电量：介质介电常数R：电荷质点间距离,（5）二硫键(DisulfideBond)由含硫氨基酸形成起稳定肽链空间结构的作用有些蛋白质的二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失，天然构象发生改变,（6）配位键(Metal-ionCoordination)两个原子之间形成的共价键共用电子对由其中一个原子提供，另一个原子提供空轨道金属离子与蛋白质的结合方式参与蛋白质高级结构的形成与维持,（7）酯键(EsterBond)Ser/Thr的羟基与AA的羧基形成酯键磷酸与含羟基AA缩合形成磷酸酯键,综上，维持蛋白质高级结构的主要是氢键、范德华力、疏水相互作用和盐键等次级键(非共价键)。在部分蛋白质中，二硫键、配位键、酯键也参与维持蛋白质的空间结构,（三）蛋白质的二级结构（SecondaryStructure）,蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象二级结构二级结构单元主要有-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲等,A.肽链中的酰胺平面绕C相继旋转一定角度形成-螺旋，并盘绕前进B.-螺旋每圈含有3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴上升0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm,（1）-螺旋结构主要特点：,1.-螺旋（-helix）,C.螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；D.链内形成的氢键几乎平行于中心轴；氢键是由每个肽基的c=o与后面第3个肽基的N-H之间形成，即每个氨基酸残基的C=O与后面第4个氨基酸残基的N-H之间形成,E.-螺旋有左手螺旋和右手螺旋两种，绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋右手螺旋空间位阻较小，构象稳定在肽链折叠中容易形成,F.多肽链能否形成-螺旋,以及形成的螺旋是否稳定,与它的氨基酸组成和序列直接有关。,多肽链中有Pro时，-螺旋就会被中断而拐弯。带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低。,由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成肽链主链呈锯齿状折叠构象,2.-折叠,（-platedsheet）,C总是处于折叠的角上AA的R基团处于折叠的棱角上并与之垂直,（1）-折叠结构特点,氢键主要在链间/同一肽链不同部分间形成几乎所有肽键都参与链内/链间氢键的交联氢键与链的长轴接近垂直,平行肽链间以氢键从侧面连接的构象,平行式：所有肽链的N-端都在同一边反平行式：相邻两条肽链的方向相反,2、-折叠的类型,-转角（turn/bend/hairpinstructure）,肽链主链骨架180的回折结构特点：由4个连续的AA残基组成第一个残基C=O第四个残基NH,形成氢键,O（氢键）HC（NHCHCO）2NR,比较稳定的环状结构,主要存在于球状蛋白分子中多数处在蛋白质分子的表面,泛指不能归入明确的二级结构如折叠片和螺旋的多肽片断,4.无规卷曲（randomcoil）,酶的功能部位常常处于这种构象区域,无规则卷曲常出现在a-螺旋与a-螺旋、a-螺旋与-折叠、-折叠与-折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的,（四）超二级结构与结构域,1.超二级结构（supersecondarystructure）若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起、相互作用，形成在空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位,超二级结构类型,12345,-链,-迂回,-迂回,结构域(domain)是指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体,2.结构域（domain）,二级/超二级结构基础上形成的特定区域结构域存在的原因：1、局域分别折叠比整条肽链折叠在动力学上更为合理2、结构域之间由肽链连接，有利于结构的调整,（五）蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构（tertiarystructure）指由二级结构元件构建成的总三维结构，包括一级结构中相距较远的肽段间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系维系力有氢键/疏水键/离子键/范德华力/二硫键,在二级结构基础上包括主链和侧链构象在内的三维结构,1、球状蛋白质分子含有多种二级结构单元,球状蛋白的三级结构特怔,2、球状蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次,4、球状蛋白质分子表面有明显的凹陷和裂隙，它常常是蛋白质的活性中心,3、球状蛋白质大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核；而极性侧链在分子表面，形成亲水面,肌红蛋白,蛋白质四级结构(quaternaryStructure）指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式每条多肽链又称为蛋白质的亚基。由两个或两个以上亚基组成的蛋白质统称为寡聚蛋白包括各亚基：种类、数目、空间排列方式亚基间的相互作用关系(接触位点和非共价相互作用力),（六）蛋白质的四级结构,1.稳定四级结构的作用力与稳定三级结构的作用力没有本质的区别主要有疏水相互作用、氢键、离子键、范德华力等,亚基缔合：相同亚基间缔合（四级结构均一的）不同亚基间缔合（四级结构不均一）亚基一般以希腊字母表示一种蛋白质中，亚基结构可以相同（烟草斑纹病毒的外壳蛋白），也可以不同（人血红蛋白A）,2.四级缔合在结构和功能上的优越性,（1）增强结构的稳定性亚基缔合可降低表面积与体积的比值，即使蛋白质内部的疏水相互作用增多，表面的与溶剂水的相互作用减少，最终总体上来讲增强蛋白质结构的稳定性,（2）提高遗传经济性和效率编码一个将装配成同多聚蛋白质的单体所需的DNA比编码一条相对分子质量相同的大的多肽链要少,（3）使催化基团汇集在一起寡聚体的形成可使来自不同亚基的催化基团汇集在一起形成完整的催化部位例：细菌谷氨酰胺合成酶的活性部位由相邻的亚基对形成，解离的单体无活性,（4）具有协同性和别构效应别构效应：一种蛋白质在执行功能时，由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子的构象、性质和功能的变化，但其一级结构不变的现象别构蛋白：具有别构效应的蛋白质,血红蛋白的别构效应,别构效应中亚基之间信息的传递是通过蛋白质构象的变化实现的，亚基之间的接触点提供了亚基之间的通讯机制别构效应具有协同性,正协同性：一种配体的结合使得其它配体更容易结合负协同性：一种配体的结合使得其它配体的结合更难,第四节蛋白质结构与功能的关系,1、一级结构的种属差异与分子进化,一、一级结构与功能的关系,不同生物与人的细胞色素C中氨基酸差异数目,2、一级结构的变异与分子病,-链N端氨基酸排列顺序12345678Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,3、一级结构的局部断裂与蛋白质前体的激活,酶原：酶的无活性的前体酶原激活例：胰蛋白酶原的激活,二、空间结构与功能的关系,核糖核酸酶S的变性-复性实验,血红蛋白的别构效应,去氧血红蛋白,氧合血红蛋白,第五节蛋白质的理化性质,一、蛋白质的两性解离及等电点,2、蛋白质的等电点（pI）当某蛋白质在一定的pH溶液中，所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等电点,1、蛋白质是两性电解质,在等电点时蛋白质溶解度最小，极易沉淀析出，用于蛋白质的分离提纯,蛋白质在溶液中可解离成带电颗粒，用电泳（electrophoresis）法进行分析、分离,二、蛋白质的胶体性质,2.蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。颗粒大小、水化膜、同种电荷相互排斥,蛋白质的相对分子质量很大，在水溶液中形成直径1-100nm的颗粒。1、具有胶体性质。如布朗运动、丁达尔效应、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。,利用蛋白质不能透过半透膜的性质，用透析（dialysis）法分离纯化蛋白质。,蛋白质的透析,三、蛋白质的沉淀反应,1、高浓度中性盐如（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等,2、有机溶剂如丙酮、乙醇等,加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析（saltingout），用于蛋白质分离制备。,3、重金属盐如Hg2+、Ag+、Pb+等,4、生物碱试剂如苦味酸、丹宁酸等5.等电点沉淀法6.加热变性沉淀法,四、蛋白质的紫外吸收与呈色反应,1、紫外吸收蛋白质在280nm处有最大光吸收，用于蛋白质的定量测定和检测,2、双缩脲反应,3、米伦氏（Millon）反应米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液，蛋白质溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。,酪氨酸和含有酪氨酸的蛋白质有此反应,4、Folin-酚试剂反应在碱性硫酸铜溶液中，酪氨酸中的酚基能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。这一反应常用来定量测定蛋白质含量,5、茚三酮反应蛋白质多肽链含有游离的-NH2，可以和茚三酮发生反应，生成紫蓝色的物质,6、考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝在酸性溶液中呈棕红色，当与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色这一反应常用来定量测定蛋白质含量,五、蛋白质的变性与复性,天然蛋白质受到某些理化因素的影响，使其空间结构发生改变时，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用（denaturation）。1、蛋白质变性的因素物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等；化学因素：强酸、强碱、脲、胍、去垢剂、重金属盐、生物碱试剂及有机溶剂等；,2、蛋白质变性后的表现丧失其生物活性；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小；基团位置改变；对蛋白酶敏感性增大。3、蛋白质的复性高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性(renaturation)。,第六节蛋白质的分离纯化,一、蛋白质的分类,1、按分子形状球状蛋白质和纤维状蛋白质2、按分子组成简单蛋白质：也叫单纯蛋白质完全水解的产物为-氨基酸结合蛋白质：也叫綴合蛋白质。简单蛋白与非蛋白质组分结合，非蛋白质部分称为辅基或配体,简单蛋白质分类,结合蛋白质分类,二、蛋白质分离纯化的过程和一般原则,（1）前处理（pretreatment）-组织细胞破碎，使蛋白质以溶解状态释放出来（2）粗分级（roughfractionation）