医学分子生物学实验ppt课件

.,1,医学分子生物学实验内容,1.实验规范化操作培训2.碱裂解法提取大肠杆菌重组质粒DNA3.PCR扩增重组质粒中GAPDH基因4.限制性核酸内切酶pvuII切割重组质粒DNA5.琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA、酶切产物、PCR产物,.,2,实验规范化操作,微量高速离心机（样品分离）移液器（微量取液）,.,3,高速离心机及使用注意事项,.,4,台式高速冷冻离心机样品的分离,.,5,落地式高速冷冻离心机,.,6,微量高速离心机操作,装液（1.5ml离心管或0.2mlPCR管）标记(记号笔)平衡（等体积相同管）放置（对称）离心（时间按钮，转速按钮）注意点：缓慢转动，记录时间停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停止后轻轻取出离心管）,.,7,使用注意事项,1.样品需对称放置；2.先调节离心时间，离心开始缓慢提高转速至设定值；3.离心结束需等转子完全停止后才能打开离心盖，取出样品。,.,8,移液器规范操作,工作原理：活塞通过弹簧的伸缩运动实现吸液和放液。,含内置活塞，依靠推动空气进行吸液和放液。,实验结束时将移液器调至最大量程！,.,9,量程的选择移液器,.,10,移液循环,吸头安装容量设定预洗吸头吸液放液卸去吸头,.,11,1、吸头安装,旋转安装法:把白套筒顶端插入吸头在轻轻用力下压的同时，把手中的移液器按逆时针方向旋转180度。切记用力不能过猛，更不能采取剁吸头的方法来进行安装，因为那样做会对您手中的移液器造成不必要的损伤。,.,12,2、容量设定,一是粗调，即通过排放按钮将容量值迅速调整至接近自己的预想值；二是细调，当容量值接近自己的预想值以后，应将移液器横置，水平放至自己的眼前，通过调节轮慢慢地将容量值调至预想值，从而避免视觉误差所造成的影响。,.,13,在容量设定时，还有一个需要特别注意的地方。当我们从大值调整到小值时，刚好就行；但从小值调整到大值时，就需要调超三分之一圈后再返回，这是因为计数器里面有一定的空隙，需要弥补。,.,14,3、预洗吸头,在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需要转移的液体吸取、排放两到三次，这样做是为了让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度，使整个移液过程具有极高的重现性。其次，在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性气体会在吸头室内形成负压，从而产生漏液的情况，这时就需要我们预洗四到六次，让吸头内的气体达到饱和，负压就会自动消失。,.,15,4、吸液,先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面，浸入的深度为：P2、P10小于或等于1毫米，P20、P100、P200小于或等于2毫米，P1000小于或等于3毫米，P5ML、P10ML小于或等于4毫米,平稳松开按钮，切记不能过快。,.,16,垂直吸液；吸头尖端需浸入液面3mm以下；缓慢吸液；,.,17,5、放液,放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿以后，再按至第二停点，这样做可以确保吸头内无残留液体。如果这样操作还有残留液体存在的话，您就应该考虑更换吸头了。,.,18,完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；按钮待液体完全打出后再放松,血清和粘性液体的吸液和放液速度都要保持缓慢,.,19,正向吸液,2个档位,1档,2档,.,20,6、卸去吸头,卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生交叉污染。,.,21,用大量程的移液器移取小体积的液体装配吸头时气密性不好，吸头不匹配吸液速度和放液速度太快,自我检测漏气：吸取液体，垂直静置5秒，观察是否有液滴流出；,规范操作，损坏赔偿！,移液不准确的常见原因：,.,22,实验报告要求,.,23,实验报告按下列要求书写,1.实验题目当次实验2.实验原理简明扼要，有针对性3.操作步骤最好是流程或表格形式4.注意事项5.实验结果图表、数据或现象6.结果分析根据实验结果，结合理论分析、体会7.思考题,.,24,碱裂解法提取重组质粒DNA,医学分子生物学实验,.,25,独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复制和遗传的辅助性遗传单位。,质粒(plasmid),.,26,碱裂解法原理,利用质粒DNA和染色体DNA的变性与复性的差异达到分离目的。强碱条件下破坏碱基配对，使宿主菌的染色体DNA变性解链，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新形成完全天然的超螺旋分子。,质粒DNA,染色体DNA,.,27,碱裂解法：,在碱性条件（NaOH,pH12.0-12.6）下，用EDTA和SDS裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。细胞壁及膜的碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成缠连的、不溶性的网状、大的复合物，在高盐条件下可有效沉淀；当pH调至中性时，质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋，保留在上清液中，经离心可与染色体DNA等分离。苯酚可变性蛋白质；氯仿加速有机相和水相分离；异戊醇减少蛋白质变性过程中产生的气泡。使用预冷无水乙醇沉淀上清液中的质粒DNA，再用70%的乙醇洗涤。,.,28,质粒DNA的提取步骤,收集宿主细菌菌体裂解质粒分离去除杂质浓缩沉淀,.,29,实验步骤：,取已培养好菌液1.4ml,8000rpm离心1min,弃尽上清（倒扣，流尽液体）；菌体沉淀重悬于100l预冷的溶液I中，振荡使菌体分散（使菌体完全重悬）；加200l溶液II，盖紧管盖，温和颠倒混匀数次，室温静止5min（避免DNA断裂)；加150l溶液III，温和颠倒混匀数次，冰浴5min；10000rpm离心5min,取上清（？l）至新的离心管中。加等体积苯酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，12000rpm离心5min；取上清（？l）至新的离心管中，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冰浴10min，12000rpm离心5min；弃上清，沉淀加1ml预冷的70乙醇洗涤，10000rpm/5min；弃尽上清，沉淀于温箱干燥后，加50lTE溶液溶解，50水浴10min后，用于PCR和酶切。（不能残留乙醇）。,.,30,溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0溶液II，0.2MNaOH/1%SDS溶液III，3M醋酸钠/2M醋酸,.,31,思考题,碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法？溶液I，II，III的作用？苯酚，氯仿，异戊醇的作用？无水乙醇，70乙醇的作用？TE溶液（pH8.0）,RNaseA的作用？,.,32,聚合酶链式反应,PCR,.,33,实验原理,PCR技术是利用DNA的变性、复性原理在体外进行特定的DNA序列高效扩增的技术，在试管中，在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶进行的酶促合成反应，由变性-退火-延伸反复循环完成扩增。,.,34,操作步骤,1.反应体系的配置2.反应条件的设置3.产物的鉴定和分析,.,35,重组质粒DNA,质粒载体2692bp,Amp,目的基因(205bp),.,36,PCR反应体系(20l),ddH2O14.0l10缓冲液（Buffer）2.0ldNTP2.0lprimer1(P1)0.4lprimer2(P2)0.4lTaq酶0.2l重组质粒DNA1.0l,空白对照：以H2O替代重组质粒DNA作为模板,请使用合适量程加样器！,20l,.,37,PCR反应步骤和条件：,预变性942min变性9420s退火5520s延伸7220s延伸725min,30cycles,.,38,思考题,PCR实验中造成假阳性的原因可能有哪些?,.,39,PCR反应产物检测,琼脂糖凝胶电泳,.,40,目的要求,掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸原理及方法；掌握荧光染料使DNA染色原理；掌握电泳结果观察分析方法;,.,41,琼脂糖,琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成的链状多糖分子，可以形成具有刚性的网孔状凝胶。琼脂糖的浓度决定凝胶孔径的大小。,.,42,-,+,.,43,实验原理,琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸最常用的方法，在pH8.0的缓冲液中，核酸带负电荷，在电场中向正极移动，由于分子筛效应，可将分子大小和构象不同的核酸分子分离，不同浓度的凝胶可分离不同分子大小的DNA片段。,.,44,1,2,3,4,5,6,.,45,.,46,琼脂糖凝胶电泳系统,.,47,紫外投射分析仪：,.,48,凝胶成像系统,.,49,琼脂糖凝胶电泳操作步骤,样品：PCR产物10l加上样缓冲液2l，加荧光染料如SybrGreenI(SG)2l，混匀取10l加入加样孔中(记录样品次序)110V稳压，电泳约至凝胶2/3处紫外灯下观察结果(与DNAMarker比较)记录并画出示意图,注意：加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外造成邻孔之间相互污染。,.,50,上样缓冲液(LoadingBuffer),上样缓冲液组成：电泳指示剂与蔗糖(或甘油)组成上样缓冲液电泳指示剂：溴酚兰（紫兰色）二甲苯青（兰色）上样缓冲液作用：1）使样品呈色，便于加样操作2）增加样品密度和比重，以确保DNA样品均匀沉入加样孔内3）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断DNA电泳的速度和位置,.,51,荧光染料(如SYBRGreenI),SYBRGreenI,荧光染料SYBRGreenI嵌入DNA的碱基平面后，本身无荧光的DNA在紫外光激发下发出荧光，且荧光强度与DNA含量呈正比。,.,52,DNA分子标准物(DNAMarker),DL2000,1kbDNALadder,100bpDNALadder,.,53,琼脂糖凝胶电泳优点：操作简便电泳速度快透明而不吸收紫外线，电泳后易染色和回收琼脂糖结构均匀，以其作为介质进行电泳得到的DNA条带清晰、分辨率高、重复性好琼脂糖凝胶电泳应用：核酸分离鉴定(质粒DNA分析)核酸产物分析(PCR产物分析；DNA酶切图谱分析)核酸纯化回收(基因克隆),.,54,影响DNA电泳迁移率的主要因素：,DNA的分子大小：线性双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。DNA的分子构象：相同分子量的闭环(型)，开环(型)和线状(型)的质粒DNA，在琼脂糖凝胶中电泳速率不同。迁移率型型型。琼脂糖凝胶的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同。在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也不同。电场强度和离子强度,.,55,线性双链DNA分子迁移率与其相对分子量成反比,M1212121212,100bp200bp300bp500bp1000bp,电泳方向,正极,负极,.,56,相同分子量不同构型的DNA分子迁移率不同,三种构型的质粒电泳模式图谱超螺旋线性开环,加样孔开环线性超螺旋,.,57,琼脂糖凝胶浓度和DNA分子的有效分离范围,.,58,DNAMarker(DL2000),M-PCR,.,59,PCR产物电泳图,300bp,引物二聚体,目的片段,1234567891011121314,1.DNAmarker2-13.PCR扩增产物14.空白对照,.,60,图1,图2,请评价和分析图1、图2PCR实验结果！,.,61,思考题：,1.琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的基本原理？2.影响DNA电泳迁移率的因素有哪些？3.上样缓冲液的成分和作用？,.,62,重组质粒的限制酶酶切,.,63,限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease,RE）,简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸内切酶，为原核生物所特有。型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。,.,64,实验原理,II型限制酶专一行性的识别4-6个具有回文结构的碱基序列，并在识别序列特定位置上切割DNA双链。酶切的效率受温度、pH、盐浓度等影响。酶切产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。,.,65,重组质粒DNA,目的基因GAPDH(205bp),质粒载体2692bp重组质粒载体2897bp,CAGCTGGTCGAC,PvuII酶切产物：535bp,2362bp,(PvuII),(PvuII),PvuII,.,66,操作步骤,1.在酶切反应管内依次加入下列试剂：ddH2O4.0uL10Buffer1.0uL质粒DNA4.0uL限制酶1.0uL2.混匀，37水浴40min3.琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果（以未经酶切的质粒做对照，并加入标准分子量DNAMarker)）,.,67,注意事项,1.保证吸样准