重组蛋白质表达、复性与纯化

.,1,复旦大学生物化学系黄伟达whuang，2005年12月8日于华东理工大学,重组蛋白质的表达、复性与纯化,.,2,为什么要重组基因表达？,1.蛋白质功能研究2.生物制药和疫苗生产3.疾病的基因治疗4.食品、化工用酶制剂5.抗虫、抗逆植物改良6.细胞代谢产物的富集,.,3,基因表达体系及优劣势大肠杆菌表达体系蛋白质的复性工作中经常碰到的问题,.,4,基因表达体系,1.原核体系2.真核体系,.,5,大肠杆菌(Escherichiacoli),遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰,.,6,枯草杆菌(Bacillussubtilis),分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体,.,7,其他,乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis),.,8,真核细胞表达体系,酵母细胞昆虫细胞植物细胞/组织哺乳动物细胞/组织,.,9,酵母细胞,可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;毕氏酵母(Pichiapastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）,.,10,昆虫细胞,可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可,.,11,CHO细胞,可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高,.,12,植物组织,植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便,.,13,动物乳腺组织,分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长,.,14,鸟类输卵管组织,分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同,.,15,体系选择,研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物,.,16,在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中生产人凝血IX因子在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化提高乳腺分泌表达的FactorIX类因子的活性在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化,有可能以后能做到的事,.,17,在大肠杆菌中表达重组蛋白质,.,18,如果目的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构,尽可能进行可溶性表达;如果目的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清,采用包含体表达比较好;如果目的多肽的分子量小于10kDa,一定要进行融合表达,.,19,按蛋白质类型分单纯表达:pJLA系列,用NcoI/NdeI导入AUG的载体融合表达:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc分泌表达:pel/ompT分泌肽按启动子分lac及衍生的tac,trc,pac,rac等启动子IPTG诱导lamdaphagePL和PR启动子热诱导T7启动子IPTG诱导T5启动子IPTG诱导ara启动子阿拉伯糖诱导,大肠杆菌表达载体分类,.,20,pJLA50X系列;pcDNAII;etcpET系列(T7promoter,Novagen公司)pQE系列(T5promoter,Qiagen公司)pMAL系列(周质表达,BioLabs公司)pGEX系列(GST融合表达,Pharmacia公司)pBAD系列(Arabinose诱导型),常用表达载体,pTYB系列(CBD融合,可以自我切割,BioLabs),.,21,ProteinAGST（glutathioneS-transferase）CBD(chitin-bindingdomain,BioLabs;cellulose-bindingdomain,Novagen)calmodulin-bindingdomain,Stratagene)MBP(maltose-bindingprotein)GFP(greenfluorescenceprotein)Thioredoxin*帮助二硫键形成Dsb(periplasmaenzymeDsbA,DsbC)*二硫键的形成与SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)KSI(ketosteroidisomerase)基本上全部沉淀,各种融合蛋白表达载体,帮助可溶化,帮助分泌到周质,可用亲和层析纯化,.,22,采用MBD融合采用GST融合采用CBD融合采用thioredoxin融合采用Origami等宿主菌降低菌体培养的速度温度(15-30),降低转速,让表达产物可溶化,.,23,采用CBD融合(pET36/37)采用Dsb融合(pET39/40)采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)采用带MBD融合(pMAL载体,Biolabs)采用带SUMO融合(pETSUMO,Invitrogen),让蛋白质分泌到间质去,纯化方便:先用EDTA/蔗糖溶液处理,然后5mMMgSO4洗出,.,24,His-tag(6-8Histidine)T7-tag(MASMTGGQQMG)HSV-tag(QPELAPEDPED)S-tag(KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK)HA-tag(YPYDVPDYA)Flag-tag(DYKDDDDK)Myc-tag(EQKLISEEDL),各种用于抗体识别的标记,为什么要加tag?,.,25,Biotinylation-tag100多AA的结构域,在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点.Promega的PinPointTMXa-1;Invitrogen的pET104-DEST.未命名DVEAWLGAR,被用来和streptoavidin结合(个人通讯)未命名一些病毒外壳蛋白的片段,破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞,有前景的特殊用途的tag,.,26,DTT:intein的Cys溴化氰:MetThrombin:LVPRGSFactorXa:IEGREnterokinase:DDDDKPreScissionTMprotease:LEVLFQGPGenenaseITMPGAAHYTEVprotease:ENLYFQG,融合蛋白的专一性切割,.,27,BL21(DE3)/pLysS:自身表达T7RNApolymerase适用pET系列等带T7启动子的载体M15/SG13009:自身表达T5RNApolymerase适用pQE系列等带T5启动子的载体BL21TrxB(DE3):thioredoxinreductase突变Origami:thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变适合带thioredoxinreductase的融合表达载体,帮助形成更多的二硫键BR21CodonPlusRIL:富含AT的真核生物基因的表达BR21CodonPlusRP:富含GC的真核生物基因的表达,特殊的表达用菌株,.,28,NovagenStratageneInvitrogenBioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheGibco/BRL,重要的原核表达质粒提供商,.,29,TheproteinfoldingProblem,Howtogettothebottomofthefunnel?And,whatisatthebottom?,.,30,透析法:简单;但费时,费缓冲液,蛋白质量少，浓度不能过高(容易产生沉淀)快速稀释法:最常用的小规模复性方法;但比较费时,费缓冲液,蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀)超滤透析法:比较省缓冲液,处理量大;但费时,要控制好蛋白质浓度凝胶过滤法:快速,可重复性高,不会产生沉淀,操作复杂一点亲和层析复性法,水相二相法,etc,包含体蛋白质的复性方法,.,31,分子伴侣(MolecularChaperone),Amolecularchaperoneisabletotransientlybindandthusstabilizeanunstableconformationofanotherprotein,therebyfacilitatingcorrectfoldingbypreventingmisfoldingandaggregation.,.,32,TypeI:chaperoneswhicharefunctionallyresponsibleforthecorrectfolding,assemblyandtransportofnewlysynthesizedpeptideHSPfamily,GroELS,ect.TypeII:chaperoneswithenzymaticpropertiesaccountableforaccelerationofratelimitingstepsofproteinfoldingPDI（proteindisulfideisomerase）,PPI（peptidyl-prolylcis-transisomerase),etc,两种主要的分子伴侣,.,33,人PDI的结构特征,.,34,PDI作用机理,.,35,PDIhasbeenshowntocatalyzereactivationofnon-nativeproteinswithoutdisulfidebonds.Thisfunctionisindependentfromtheredox/isomerasefunction,asithasbeenshowntoexistinvitrowithseveralmodelsubstratesthatdonotcontaindisulfidesintheirnativestructure.,Foldingassistant/chaperone,.,36,TimedadditionofPDItorefoldingFab/red.,MarcusMayeretal.,BiPandPDICooperateintheOxidativeFoldingofAntibodiesinVitro,JBCVol.275,No.38,2000,.,37,MarcusMayeretal.,BiPandPDICooperateintheOxidativeFoldingofAntibodiesinVitro,JBCVol.275,No.38,2000,.,38,PPI的作用,Prolineisomerizationiswidelyacceptedtobeoneoftherate-determiningstepsinproteinfolding.ThefunctionofPPIistoacceleratethecis-transisomerizationprocess.,MolecularChaperon,.,39,CyclophilinFamily,典型的PPI,.,40,RefoldingofHCAII,HCAII,HCAIIwithPPl,HCAIIwithPPlandCsA,P202NmutantwithPPI,P202Nmutant,Reactivationwasinitiatedbyrapiddilutionof0.3MGuHClandaproteinconcentrationof0.025mg/ml(0.83,uM).PPI:9.6M;CsA:25M,.,41,表达量不够高；包含体在8M尿素中不能溶解；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上；Ni-chelating分离纯化的效果不好；GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高,工作中经常碰到的问题,.,42,尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体,.,43,是不是忘了加还原剂（DTT或巯基乙醇）？是不是在20冻存过？用4M盐酸胍试试,.,44,是不是酸性蛋白质？是不是蛋白质的合成提前中止了？（富含Arg,Ile,Leu,Pro这几种氨基酸）可以尝试用BL21CodonPlusRIL或RP作宿主菌(Stratagen)；使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21,Novagen）以便纯化全长的融合蛋白,.,45,His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5mMEDTA来去除重金属离子的干扰；His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）;其