猪脾中DNA的提取及含量测定

.,1,猪脾中DNA的提取,指导教师：滕利荣Email:tenglirong2005.03,.,2,二十世纪是,二十一世纪是,物理、化学和电子科学,生命科学,的世纪,的世纪,生命是,生命=核酸+蛋白质,二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪,？,.,3,1、用于研制核酸类药物及保健品2、用于基因诱变3、用于DNA克隆4、用于DNA测序5、用于PCR扩增,DNA提取的意义：,.,4,提取DNA的主要来源：,1、动物组织及器官脾、肝、胸腺、鱼类精子等。2、植物种子的胚芽等3、微生物细菌、酵母菌等,.,5,核酸的存在形式：核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在；真核生物的染色体DNA为双链线性分子；原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。,.,6,.,7,核酸的分布：95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子则主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中。,.,8,1、核酸的理化性质DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。核酸和核苷酸大都呈酸味（除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外）。DNA、RNA和核苷酸都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。,.,9,在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。,.,10,核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示；DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。,核酸提取的原理,.,11,从不同材料中提取DNA的方法不同，分离提取的难易程度也不同。从高等动植物及细菌中提取DNA难度大一些。由于其DNA分子量较大。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。,.,12,对于低等生物。如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。,.,13,核酸提取的主要步骤：1）破碎细胞；2）去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子；3）去除其它不需要的核酸分子；4）沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质。,.,14,核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，事先提取该细胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。,.,15,有坚硬的细胞壁的细胞，首先要破碎细胞。方法有三种：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞；酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。,2.细胞的破碎,.,16,高等动物的DNA主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：1）破碎细胞难，从处死动物分离组织器官到破碎细胞费时长。在长时间内DNA可能会被DNase降解；2）因分子量大，在使用组织匀浆器破碎组织时易造成DNA断裂；对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。,.,17,3.DNA提取的几种方法(1)浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。1）用1M氯化钠提取,得到的DNP粘液;2)与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化;3)离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中;4)用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.,.,18,（2）阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。,.,19,（3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。,.,20,猪脾中提取DNA,.,21,1.实验材料，仪器和试剂：（1）实验材料：新鲜猪脾：（2）仪器：量筒：10ml、100ml3个；烧杯：100ml2个、250ml2个；磨口锥形瓶：250ml1个、500ml1个；移液管：1ml1支、10ml1支；滴管、玻棒、离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。,.,22,（3）试剂：20SSC：175.2gNaCL，88.2g柠檬酸钠2H2O，PH=7.0加水至1000ml；1SSC，0.1SSC由作相应的稀释得来；NaCL-Na2EDTA液：8.77gNaCL，3.72gNa2EDTA溶于800ml蒸馏水中，用固体NaOH调PH=8后定容至1000；5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙醇中；氯仿-异戊醇=24：1（体积比）其他:95%乙醇，盐，冰.,.,23,2.操作步骤:取鲜猪脾,去脂、血,称取5g,用预冷的1SSC溶液洗2次，剪碎；按脾：1SSC=1;5W/V加入25ml预冷的1SSC，用高速组织捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒；将匀浆液放在烧杯中，于冰盐浴中冷却10分钟。4，8000rpm离心5分钟。去掉上清，取；沉淀物中再加2倍体积的1SSC搅匀，离心，弃上清，取，重复2次。,.,24,将所得沉淀悬于5倍体积的PH8.0、0.15MNaCL-0.1Na2EDTA溶液中。边搅拌边慢慢滴加5%SDS最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L，继续搅拌，以确保氯化钠全溶。,.,25,所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿异戊醇，激烈振荡10分钟，8000r离心10分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同积氯仿异戊醇重复去蛋白2次。,.,26,取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干。,.,27,1、鲜猪脾去脂、血5g预冷的1SSC洗2次剪碎,1SSC=1:5(W/V）捣碎(85s，间隔30s)匀浆液冰盐浴冷却10min4,8000rpm,5min沉淀物2V1SSC,搅匀4,8000rpm,5min弃上清(重复2次)沉淀,操作步骤,3、水相搅拌95%乙醇至溶液澄清DNA纤维挤干70%乙醇洗DNA纤维2次95%乙醇,乙醚取出并挤干DNA纤维,.,28,二苯胺显色法测定DNA含量,强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2脱氧核糖在酸性环境中成为羟基酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400g范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。,.,29,、二苯胺试剂：使用前称取0.8g二苯胺（需在70%乙醇试剂中重结晶2次)，溶于180ml冰乙酸中，再加入8ml过氯酸（60%以上），混匀待用，临用前加入0.8ml1.6%乙醛溶液，所配试剂应为无色。每组需56ml共需2800ml、DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准DNA以0.01NNAOH配成200微克/毫升的标准液。每组需12ml共需600ml、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。共需70ml、待测样品液：准确称取猪脾DNA5mg,用0.01mol/L的氢氧化钠溶液配成100微克/毫升的溶液。每组需4ml共需200ml,.,30,操作方法：1.DNA标准曲线的制定：取10支试管，分成2组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。另取2只试管，各加2ml蒸馏水作为对照。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于60度恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。,.,31,2.制品的测定：取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。3.根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。,.,32,数据:DNA纯度：待测液中测得的核酸微克数DNA%=X100待测液中制品的微克数DNA产率:测得的DNA的微克数DNA%=X100原料的微克数,.,33,1.为什么在低温下进行？2.加柠檬酸钠和EDTA的作用?3.加SDS的作用？4.加NaCL的作用，为什么要加到1mol/L?5.加入异戊醇有什么作用？,.,34,生物学基础实验教程.滕利荣主编.长春:吉林科学技术出版社,1999.8,573578.现代分子生物学实验手册.张维铭主编.北京:科学出版社,2003.6,80106.精编分子生物学实验指南.颜子颖、王海林译.北京:科学出版社,1998.6,3040.生物化学与分子生物学实验技术.厉朝龙主编.杭州:浙江大学出版社,2000.6,107116分子克隆实验指南(第三版).黄培堂等译.北京:科学出版社,2002.8,2652.生物化学与分子生物学实验教程.梁宋平主编.北京:高等教育出版社,2003.3,1619.生物化学实验(第三版).陈钧辉,陶力等编.北京:科学出版社,2003.4,128130.生物化学实验指导.余冰宾主编.北京:清华大学出版社,2004.1,158160.生物化学实验方法和技术.陈毓荃主编.北京:科学出版社,2002.8,127132,.,35,二、DNA提取技术,技术1：基因组总DNA的大量提取本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。仪器：高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外分光光度计。,.,36,试剂：细胞裂解液（100mMTris-HCl5mMEDTA500mMNaCl1%SDSpH7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3MNaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液,.,37,操作：动植物材料10g(鲜组织)0.5g(干冻组织),液氮，研碎,10ml裂解液(含1/10体积酚),(65预热),(加入等体积氯仿),(65，30min间隔510min轻摇一次),离心(12000-15000rpm,15min),上清液,(0.6体积冷异丙醇),(0.1体积3MpH5,2乙酸钠）,.,38,2mlTE(或水)10ulRNase，65,10-30分复溶和除RNA,挑取絮状体,（70%冷乙醇洗涤,真空干燥）,（5000RPM，5min）,等体积酚/氯仿,氯仿抽提,（轻轻混匀、冰浴沉淀5min）,2倍无水乙醇、1/10体积醋酸钠,上清液,.,39,(10000RPM,10min),(-80，30min),(70冷乙醇洗),沉淀,基因组DNA干粉,(真空干燥),保存：干粉-20保存，或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积,-20或4保存,.,40,注意:裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解；2.各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解；3.取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰；4.异丙醇,乙醇，醋酸钠，醋酸钾等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀；5.本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省钱的特点。,.,41,技术2：细菌基因组DNA的微量提取法本方法包括SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分等内容。仪器：同技术1；试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；NaCL；20mg/ml蛋白酶；CTAB/NaCL溶液(10%CTAB，0.7MNaCL4.1gNaCL溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)；氯仿/异戊醇(24：1)；异丙醇；70及100%乙醇,.,42,操作：,1.5ml对数生长期细菌,100lNaCL(5M)，混匀,30l10%SDS,3L蛋白酶，混匀,沉淀，溶于500lTE缓冲液中，混匀,(37,1小时),(5000rpm,1min离心),80l的CTAB/NaCL,混匀；6510min（可不做）,.,43,加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,取上清，以下操作与技术1中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致,(混匀),(离心12000rpm,4-5min),上清,.,44,技术3：酵母菌基因组DNA的提取仪器：同技术1；试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTApH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20PVP；蛋白酶K缓冲液（10mMTrispH7.60.5%SDS1mMEDTA）；其余同前,.,45,操作：,1.5ml对数生长期细菌,溶于590ulSE缓冲液中混匀,(12000rpm,8-10min离心),(12000rpm,1-2min离心),加入1.2ml的CTAB/NaCL,200l20%PVP混匀,(加入10ul溶菌酶37,1小时),溶于100ulNaCL中混匀,(加入0.5l蛋白酶，37,1小时),.,46,等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,(6530min),(12000rpm,4-5min离心),上清,以下操作与技术1中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致。,.,47,为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。对于核酸的纯