研究生课时-色谱技术发展及应用

研究生学科知识讲座,色谱技术发展及应用,湖北大学化学化工学院,DevelopmentandApplicationofchromatography,E-mail:hxchTel15337244620,陈怀侠教授,主要内容,色谱法的发展质谱法的发展气相色谱法及气质联用液相色谱法及液质联用,化学学科,现代分离方法,电化学分析,光谱分析,CE,LC,GC,知识内容立足点,经典色谱法Chromatography,1905年俄国植物学家M.G.茨维特,柱色谱纸色谱薄层色谱,一、色谱法的发展,MichaelTswett(1872-1919),aRussianbotanist,discoveredthebasicprinciplesofcolumnchromatography.Heseparatedplantpigmentsbyelutingamixtureofthepigmentsonacolumnofcalciumcarbonate.Thevariouspigmentsseparatedintocoloredbands;hencethenamechromatography.,石油醚,现代色谱法,1952年气相色谱分析法,NationalInstituteforMedicalResearchLondon,UnitedKingdom,MartinAJP,RowettResearchInstituteBucksburn(Scotland),UnitedKingdom,SyngeRLM,色谱法的发展历史,色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作,色谱法分类,按固定相的形态分类,柱色谱：填充柱、整体柱、毛细管或开管柱平面色谱：薄层色谱和纸色谱,按色谱动力学过程分类,淋洗色谱法置换色谱法迎头色谱法,按两相的物理形态、分离机理等分类,色谱法分类,色谱法特点及与其他分离分析方法比较,分离效率高；分析速度快；检测灵敏度高；样品用量少；选择性好；多组分同时分析；易于自动化；定性能力较差。,色谱法的优缺点：,色谱法特点及与其他分离分析方法比较,（1）色谱、精馏与萃取：平衡分离方法。（2）色谱法与精馏、萃取比较：速度快、效率、选择性高。（3）精馏不能分离沸点相同的组分，萃取不能分离在溶剂中溶解度相同的组分；色谱法可分离沸点、溶解度相同的组分，可分离物理、化学性质相近、其他分离方法不能或难以分离的组分。（4）色谱法每次处理样品量少。,与精馏、萃取比较,与化学分析比较（1）不受化学性质限制，是一种分离分析方法。（2）化学分析本身不具备分离功能。（3）化学分析一般不适用于分析多组分的混合物。（4）化学分析定量方法简易；色谱法定量测定较复杂。,与光谱、质谱方法比较（1）光谱、质谱用于物质定性鉴定，色谱法定性功能差。（2）色谱法最主要特点是适于多组分复杂混合物分离分析。（3）色谱仪价格比分子光谱、质谱仪低得多，适用范围广。（4）色谱检测器比分子光谱法灵敏度更高，比质谱灵敏度低。,现代分离方法两重含义,样品前处理方法：各种提取、分离技术液液提取LLE、液相微萃取LLME固相萃取SPE、固相微萃取SPME微波辅助溶剂提取、加速溶剂提取超声辅助溶剂提取现代分离分析方法:气相色谱GC、高效液相色谱H(U)PLC、毛细管电泳CE、超临界流体色谱SFC,复杂样品分析思路,获取样品中所有或大多数组分的信息基因组学、蛋白组学、代谢组学、中药分析等获取样品中一个或多个组分的信息环境污染物分析、食品中农药兽药分析、体液中药物分析、材料分析等,举例：JournalofChromatographyB,881882(2012)3441,Developmentandvalidationofasensitivesolid-phase-extraction(SPE)methodusinghigh-performanceliquidchromatography/tandemmassspectrometry(LCMS/MS)fordeterminationofrisedronateconcentrationsinhumanplasma,利塞膦酸钠,1918年J.J.Thomson发明了第一台质谱；1966年Munson和Field提出了CI电离技术；1981年出现了快原子轰击（FAB）电离技术；随后出现了各种软电离技术：如基质辅助激光解吸电离源（MALDI）；电喷雾电离源（ESI）；大气压化学电离源（APCI）；感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）；富立叶变换质谱仪（FT-ICRMS）；,二、质谱法的发展,1.唯一可以确定分子量的方法，特别是现代生物质谱适用于生物大分子分子量（数十万）定；2.极高灵敏度，检测限达10-14g；,质谱法特点,按离子源分类,1.电子轰击源(electron-impactsources,EI),硬电离,一般有机化合物的电离电位为715eV，被具有电子能量70eV的加速电子轰击后，除了失去或得到一个电子形成分子离子以外，处于激发态的分子离子进一步裂解形成碎片离子和游离基，也可能失去一个中性分子。即70eV能量时，得到丰富的指纹图谱，灵敏度最大。适当降低电离能，可得到较强的分子离子信号，有助于确定分子量。,EI电离：将具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离，且效率高，有助于质谱仪获得高灵敏度和高分辨率。,EI图谱特征：,灯丝,电子束,试样高温气化,EI离子源,EI源：可变的离子化能量(1070eV),电子能量,电子能量,分子离子增加,碎片离子增加,标准质谱图基本都是采用EI源(70eV)获得,EI适用于Mr103的易挥发有机物,EI优点：灵敏度高，适用性强，图谱重现性好，有标准图谱对照。缺陷：气化时造成分子热裂解，图谱复杂，分子离子峰难寻找。,（1）分子离子(Molecularion),EI源离子类型,分子离子,中性分子,确定分子量和分子式,C6H13Br,Mr=164,含硫的样品32S:33S:34S=100:0.8:4.4,（3）碎片离子(fragmention),1)断裂,带有电荷的官能团与相连的碳原子之间的断裂,断裂方式均裂：XY=X+Y异裂：XY=X+Y-半异裂：X+Y=X+Y,已电离,含不饱和杂原子,均裂,烯烃(烯丙断裂),烷基苯(苄基断裂),2)断裂,碳原子和碳原子之间的键的断裂,3)断裂,较易发生,（4）重排离子(rearrangemention),麦氏(Mclafferty)重排,R1=H、R、OH、OR、NR2,（5）亚稳离子(metastableion):m*,离子源内,亚稳离子（m1速度，m2质量）,离子源后飞行中,特点：强度低、宽、跨几个质量数，m/z非整数，易辨认用处：证明m1m2裂解过程,2.化学电离源(chemicalionizationsources,CI),甲烷电离,甲烷离子与分子反应生成加合离子,软电离,反应气体有甲烷、丙烷、氨气、异丁烷等,90%,加合离子与样品分子反应,(M+17)+,(M+29)+,CI电离规律：,CI电离与样品化合物类型及反应气体有关：（1）反应气体影响：甲烷：有M+H+、M-H-、M+C2H5+或M+C3H5+异丁烷：有M+H+、M+C4H9+氨：有M+H+、M+NH4+（2）化合物结构影响：电负性强的元素电子捕获（或再分解）生成负离子：有M-、M-H-及其分解离子。CI源会产生一些碎片离子，碎片会进一步离子-分子反应,CI源特点：,解释CI谱时，要综合分析CI谱、EI谱和所用的反应气，推断出准分子离子峰。,优点：图谱简单，易测得分子量（主要任务），正、负离子模式灵敏度相当。适用于易汽化的样品。缺点：不适于难挥发成分的分析，没有标准谱库。,3.大气压电离（Atmosphericpressureionization,API）,API是主要应用于HPLC和质谱联用时的电离方法,两者都是很软的电离方法，易于得到样品的分子量。有ESI和APCI两种方式。,最软电离,样品从具有雾化气套管的毛细管端流出时在电场和雾化气的吹带作用下喷成无数的带电微液滴，一定温度下，液滴中的溶剂快速蒸发，液滴直径不断变小，表面电荷密度不断增大。最终使溶剂和样品离子从液滴中被排挤出，样品离子进入分析器被检测。,（1）电喷雾电离源(ElectrosprayIonizaton，ESI),高电场,强静电场（3-5KV），形成高度荷电雾状小液滴，经过反复的溶剂挥发-液滴裂分后，产生单电荷或多电荷离子。,ESI离子源,ESI特点：最软电离技术单电荷或多电荷离子利于极性强、不稳定的生物大分子的测定,东莨菪碱ESIMS图谱,ESI源离子类型,有机小分子（1000Da以下）：一级质谱（MS）：单电荷准分子离子，很少碎片（1）分子离子峰：M+或M-（2）准分子离子峰（加合离子）：和溶液组成有关M+H+、M-H-、M+Na+、M+K+、M+NH4+碱性化合物易生成质子化的分子M+H+；酸性化合物，易生成去质子化离子M-H-。（3）聚合离子：2M+H+、2M+Na+、2M-H-、3M+H+二级质谱及多级质谱（MS/MS）：裂解规律同EI相似，但主要丢失为中性分子，很少丢失自由基。,生物大分子：一级质谱（MS）为多电荷多离子，计算拟合获得分子量；二级质谱及多级质谱（MS/MS）产生特征碎片离子。,图1马心肌红蛋白的ESI质谱图图2溶菌酶样品的ESI质谱图,（2）大气压化学电离(Atomsphericpressurechemistryionization,APCI),APCI结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷咀的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。APCI电离机理：质子转移和电荷交换产生正离子；质子脱离和电子捕获产生负离子等。,APCI示意图,APCI应用特点：（1）主要用来分析中等、弱极性小分子化合物。（2）有些分析物由于结构和极性方面的原因，ESI不能产生足够强的离子，可采用APCI方式增加离子产率，APCI是ESI的补充。（3）与CI不同，APCI无须加热样品使之汽化，因而应用范围更广。,APCI电离特征：主要产生的是单电荷离子M+H+或M-H-，分析的化合物分子量一般小于1000Da，很少有碎片离子，主要是准分子离子。,银杏叶中聚戊烯醇化合物APCI-MS,M-CH2OH,4.基质辅助激光解析质谱（Matrix-assistedLaserDesorptionIonization，MALDI）,用小分子有机物作基质，将样品溶液和基质混合均匀，干燥成为晶体或半晶体后送入离子源内。用一定波长的脉冲式激光照射，基质分子能有效地吸收激光能量，瞬间由固态转化为气态，基质离子与样品相互碰撞使样品离子化，而得以进行质谱分析。,MALDI示意图,常用基质：2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、2-氰基4-羟基肉桂酸等,MALDI特点：准分子离子峰很强，碎片离子峰很少，能直接测定难于电离的样品，特别是生物大分子物质如多肽、核酸、蛋白等。适于结构复杂、不易气化的大分子，并引入辅助基质减少过分碎裂。一般采用固体基质，基质样品比为10000/1。根据分析目的不同使用不同的基质和波长。,5.快原子轰击（fastatombombardment,FAB）,FAB电离原理：样品溶液与甘油、硫代甘油、3-硝基苄醇等高沸点的溶剂混合滴加于样品靶上。由铯枪（或Ar、Xe）产生的高能快原子轰击到样品靶上时，部分能量导致样品气化和电离。生成的离子束由一加速电压（数kV）引出，进入质量分析器，按不同的质荷比（m/z）被分开，并检测器检出。,FAB电离特点：（1）准分子离子为主，少许碎片离子；（2）常见的离子有M+H+、M-H-；（3）加合离子有M+Na+、M+K+，样品滴在Ag靶上时，会出现M+Ag+，用甘油作为基质，生成的离子中还会有样品分子和甘油生成的加合离子。（4）既可以得到正离子，也可以得到负离子。（5）在基质中加入不同的添加剂，会影响离子的强度。加入乙酸，三氟乙酸等会使正离子增强，加入NH4OH会使负离子增强。,FAB应用特点：FAB是一种软电离技术，被分析样品不须经过气化而直接电离，故常用于分析极性强、不易气化和热稳定性差的样品，如氨基酸、多肽、糖类、维生素、抗菌素等。,苯芴醇FAB-MS,分子式：C30H32Cl3NO分子量：528.94,质谱法的应用,定性分析,标准谱图检索定性：EI(70eV)标准谱库：书库、数据库、网络检索相对分子质量测定：根据电离方式、测试条件和化合物分子结构特点，获得分子量,未知化合物的结构分析,分子量的确定：分子离子峰的识别,分子式的确定：高分辨质谱法和同位素丰度法,分子结构的确定：计算不饱和度，特征离子和特征碎片丢失,定量分析,质谱直接定量分析：应用少,复杂混合物定量分析：GC-MS、LC-MS、CE-MS.,三、气相色谱法及气质联用,1、气相色谱法（GC）,英国生物化学家MartinATP等人在研究液液分配色谱的基础上，于1952年创立的一种极有效的分离方法，它可分析和分离复杂的多组分混合物。,目前，高效能的色谱柱，高灵敏度的检测器及微处理机的使用，使得GC成为一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析方法。如气相色谱-质谱（GC-MS）、气相色谱-Fourier红外光谱(GC-FTIR）、气相色谱-原子发射光谱（GC-AES）联用等。,GC特点,高选择性：可用在性质极为相似物质（如同位素、同系物、烃类异构体等）的分离与测定。高效能：可以分析极为复杂的物质，如：石油烃、燃烧产物等高灵敏度：可检测出10-1110-13g的物质量，因而可对痕量组分进行分析。如：大气污染监测10-910-12级的毒物；农副产品、水果、食品、水质中的10-610-9g的农药残留量。,GC进展,灵敏度高：比一维色谱提高20-70倍；分辨率高、峰容量大：两柱峰容量乘积分离效率高、快速：,（1）全二维气相色谱技术：,非极性柱+极性柱串联，调节极性和温度实现正交化色谱分离。,特点：,（2）顶空气相色谱法（headspacegaschromatography）,静态法：恒温密闭系统，平衡时，测定气相组成；动态法：吹扫-捕集法，采用吸附剂吸附，加热解吸。,原理：,试样置于密闭恒温系统中，气-液（固）两相达到热力学平衡时，测定气相组成。,特点：,对液体或固体试样中的挥发性成分分析,方式：,应用1：,在职业病和法庭分析中，经常测定体液中苯、甲苯和二甲苯等有毒成分。司法部制定了分析水、尿和血中苯类化合物的静态分析方法,方法：,5mL青霉素小瓶中取1mL试样，加0.4g内标物和1g硫酸铵至饱和，加盖密封，置于80恒温器中30min，取0.6mL顶空进样分析。色谱柱：2m2mm；80-100目；固定液为PEG20M柱温：100，10/min程序升温到110,应用2：,血样中酒精分析，检查司机是否酒驾。方法：样品平衡温度：平衡时间：30min色谱柱：30m0.53mm；石英毛细管柱固定液：聚二甲苯硅氧烷,应用3：,将塑料食品包装袋剪成30mm10mm，装入100mL玻璃注射器，80预热20min，用空气稀释为100mL，恒温10min后进样分析。色谱柱：500mm3mm；80-100目填充柱固定液：20%PEG20M柱温：80最小检查浓度为0.31mg/m2,固体样品（塑料、食品等）顶空分析：塑料食品包装袋中的甲苯残留量测定,方法：,（3）裂解气相色谱法（pyrolysisgaschromatography，PyGC）,原理：,一定条件下，高分子及非挥发性有机化合物遵循一定的裂解规律，即特定的样品能够产生特征的裂解产物及产物分布，采用GC分析，鉴定裂解产物，对样品进行表征。,方法：,样品置于裂解器中，严格控制条件，快速加热，使之迅速分解为可挥发的小分子产物，然后直接将裂解产物送入色谱柱分离，获得定性和定量数据。,流程：,载气,六通阀,压力表,气化室,色谱柱,裂解器,GC检测器,质谱仪,数据处理,数据处理,进样,特点：,分离效率高灵敏度高分析速度快：快速裂解、快速分析、无信息丢失信息量大：裂解条件与裂解产物关系；样品组成与裂解产物；裂解机理和反应动力学研究适合各种形态样品：粘稠液体、粉末、纤维、固体树脂、涂料、塑料等简单易行,应用：,较大分子量、结构复杂、难挥发和难溶解物质的分析鉴定，如聚合物分析热裂解+GC+MS（IR、NMR）是研究高分子化合物的有力工具；在高分子、生物医学、环境科学、考古学、地球化学和炸药等领域应用广泛。,GC应用,石化分析：汽油单体烃分析等环境分析：多氯联苯、氯化硼烷等多组分生物药剂：药物吸收、分布、代谢、排泄及毒性和剂型关系白酒分析：醇、醛、酸、酯等,GC发展前景,GC色谱柱开发：选择性、寿命、成本、规格等专用分析系统：芯片化、模块化、快速、可靠和自动化、网络化专用分析软件开发：专用化、网络化和远程支持性能等,2、气相色谱-质谱联用,1957年HolmesJC和MorrellFA开发GC-MS联用技术,兼顾GC和MS的优点：快速多组分定性定量分析测定分子量同时还具有：（1）GC进样：提高混合物分离、定性和定量效率（2）MS检测：提高适用性、选择性和灵敏度（3）专属性好：t、m/z及强度三维信息，定性能力强,GC-MS特点：（和GC、MS比较）,GC-MS能解决的问题：（1）复杂混合物的成分分析石油烃类及非烃类、化工原料组成、酒中醇、醛、酸和酯、天然产物萜类和甾类、中草药成分、烟草成分、香精香料配方等（2）杂质成分的鉴定和定量分析；含量低，加大进样量或浓缩（3）目标混合物残留的定量分析：环境保护、疾病控制、药物代谢、兴奋剂、毒品、食品安全等,GC-MS应用：,1、高效液相色谱法（HPLC）,高压泵,流动相溶剂,废液,色谱柱,检测器,WatersUPLC超高效液相色谱仪,20世纪60年代末70年代初发展起来,四、液相色谱法及液质联用,基本理论,塔板理论,速率理论,A涡流扩散项B/u分子扩散项（忽略）Cu传质阻力项,分离模式,吸附色谱法（液固吸附色谱LSC）,分配色谱法（液-液分配色谱LLC+键合相色谱）,离子交换色谱法（IEC）,化学键合相色谱,尺寸排阻（凝胶）色谱法SEC、GPC,亲和色谱,HPLC特点,高效液相色谱法的优点（与经典液相色谱法与气相色谱法比较）（1）分离效能高（2）选择性高（3）检测灵敏度高（4）分析速度快（5）应用广泛，适于沸点高、热稳定性差的物质（占70-80%），特别是蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。,Highperformanceliquidchromatography,HPLC,方法特点,（1）分离分析同时完成：融分离和检测于一体，可以实现复杂混合物的多组分同时分析。（2）多种检测器，适用对象广：紫外UV、二极管阵列PAD、荧光、化学发光、电化学、质谱MS等。（3）仪器联用，多重信息，定性能力强：LC-MS(NMR、IR)保留时间定性、光谱定性、质谱及串联质谱定性等。（4）仪器联用，灵敏度高，专属性好：强大的分离功能和质谱的高灵敏度、高专属性。（5）分离模式多，适用范围广：生物、药物、食品、环境、材料、农业、医学等。,HPLC-PAD图谱,光谱定性峰纯度检验,根据被分析样品的特性选择适