超声波萃取-高效液相色谱测定咖啡粉和速溶咖啡中的葫芦巴碱

L】04色谱第29卷图1葫芦巴碱的化学结构FIG1CHEMICALSTRUCTUREOFTRIGONELLINEEC和核磁共振NMR”等。目前咖啡葫芦巴碱含量测定常用方法为HPLC法。CASAL等采用ODSC18柱、甲醇和磷酸缓冲盐梯度洗脱分离咖啡中的葫芦巴碱。FRANCA等采用C18柱、甲醇和乙酸梯度洗脱分离咖啡中的葫芦巴碱。这些方法大部分采用热水浸提2H以上，无净化处理，耗时、污染仪器，不利于日常、大批量样品的检测。随着国际咖啡企业对云南小粒咖啡品种的认可并收购其原材料，云南省也投入巨资大力发展咖啡产业，但尚欠缺科学系统的质量控制与综合评价体系。本文建立了简单、快速测定咖啡中葫芦巴碱的地方标准，对云南省咖啡豆原料及其制品的质量控制、资源合理开发利用具有重要的指导意义。1实验部分11仪器及试剂ALLIANCE2695型高效液相色谱仪WATERS公司，配四元泵溶剂淋洗系统、自动进样系统、2487紫外检测器；HB50型超声波萃取仪功率50W，频率40KHZ，容量2L，南京莱步科学器材公司；HS20500D型超声波萃取仪可选三档，最大功率500W，频率40KHZ，容量20L，天津恒奥科研有限公司；ARIUM611DI型纯水器SARTORIUS公司。标准品和试剂葫芦巴碱纯度98，中国生物药品检定所研制。色谱纯甲醇FISHER公司，醋酸锌、亚铁氰化钾、磺基水杨酸均为分析纯国药集团化学试剂有限公司。通过企业送检方式收集焙烤咖啡粉和速溶咖啡样品各5份，均为云南小粒咖啡。将样品于常温下保存。12色谱条件色谱柱BONDPAKNH，250NLM46MM，5M；WATERS公司；流动相甲醇一水8218，VV，柱温30；流速08MLMIN；检测波长260NM；进样量10L。13标准曲线精密称取葫芦巴碱标准品L0MG，置于L0ML容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，得葫芦巴碱贮备液1000MGL。用水将其分别稀释为1、4、10、20、40MGL系列质量浓度的标准溶液。分别取10L进样测定，以葫芦巴碱的峰面积对其质量浓度作标准曲线。14超声萃取样品前处理精密称取05G咖啡样品，置于250ML锥形瓶中，加入80ML水，室温下超声萃取5MIN，滤纸过滤，加入1ML5磺基水杨酸溶液于滤液中，摇匀，转移定容于100ML容量瓶中，经045,M滤膜过滤，滤液供HPLC分析。15热浸提样品前处理参照文献6，8，L5的方法，精密称取05G样品，置于250ML锥形瓶中，加入80ML热水沸腾，于80水浴中萃取2H，过滤，冷却后加入LML5的磺基水杨酸于滤液中，摇匀，转移定容于100ML容量瓶中，经045M滤膜过滤，滤液供HPLC分析。2结果与讨论21超声萃取时间的优化试验在HB50超声波萃取仪的功率50W和频率40KHZ固定条件下，比较不同的超声萃取时间030MIN时葫芦巴碱的提取率，每个试验重复3次。由于葫芦巴碱的水溶性好，超声萃取前76的葫芦巴碱能溶解于水。萃取时问在530RAIN内，葫芦巴碱萃取率的变化值小于1，因此5MIN能完全萃取葫芦巴碱。22超声波功率对萃取葫芦巴碱的影响在HS20500D超声波萃取仪的频率设定为40KHZ，功率分别设定为125、250和500W条件下，分别对咖啡样品进行30S、1MIN、2RAIN和3MIN的萃取。在125W下萃取3MIN，葫芦巴碱的萃取率可达97；在500W下萃取1MIN，葫芦巴碱萃取率可达98。结果表明，超声波功率大，短时间内萃取效率高。本实验选择在HS20500D超声波萃取仪最大功率500W下进行萃取。23蛋白质沉淀剂的选择由于速溶咖啡中蛋白质较多，萃取液混浊，经滤纸过滤后直接用045M的滤膜很难过滤，需净化处理。比较了5磺基水杨酸和10醋酸锌10亚铁氰化钾混合溶液对咖啡中蛋白质的沉淀作用。通过加标试验可知，在经滤纸过滤后的萃取液中加入1ML10醋酸锌1ML10亚铁氰化钾沉淀剂，葫芦巴碱的回收率为0；加入1ML5磺基水杨酸沉淀剂，葫芦巴碱的回收率为94。进一步试验表明，在咖啡粉的萃取液中加入磺基水杨酸沉淀剂，色谱第29卷表2日间测定葫芦巴碱含量的重复性TABLE2REPEATABILITYOFTRIGONELLINECONTENTDETERMINEDININTERDAYTEST29咖啡粉和速溶咖啡样品的测定经测定，云南焙烤咖啡中葫芦巴碱的含量范围为235421GKG，是巴西焙炒咖啡中葫芦巴碱含量的12，说明云南省咖啡加工工艺导致葫芦巴碱的损失大；速溶咖啡中葫芦巴碱的含量范围为02870524GKG，比焙烤咖啡中葫芦巴碱的含量低一个数量级。因此，要品尝咖啡特殊的香气、口感，最好饮用焙烤咖啡。3结语采用超声波萃取咖啡中的葫芦巴碱能缩短分析时问，提高分析效率；用NH柱分离葫芦巴碱可以弥补反相C18柱对葫芦巴碱吸附弱、柱效低等弱点。准确度和精密度试验结果表明该方法准确可靠，可以用于例行和大量样品的分析检测工作。表3不同人员测定葫芦巴碱含量的重复性TABE3REPEATABITYOFTRGONELNECONTENTS参考文献DETERMINEDBYTWOANA1STSRSDRELATIVESTANDARDDEVIATION；RDRELATIVEDEVIATION28回收率试验在已知葫芦巴碱含量的咖啡粉或速溶咖啡中分别加入10、20、40GKG或02、04、08GKG3个含量水平的葫芦巴碱，每个添加水平样品重复测定5次，计算回收率。从结果见表4可知，所有样品中葫芦巴碱的加标回收率大于90以上，RSD301。表4咖啡样品中葫芦巴碱的加标回收率5TABLE4RECOVERYOFTRIGONELLINESPIKEDINCOFFEESAMPLESN51KYCL，LOUARNJ，DUSSERTS，ETA1FOODCHEM，2001，752232LANGR，WAHLA，STARKT，ETA1MOLNUTRFOODRES，2011，DOIL01002MNFR2010006563OLTHOFMR，VANDIJKAE，DEACONCF，ETA1NUTRMETAB，2011，8104BAKURADZET，LANGR，HOFMANNT，ETA1MOLNUTRFOODRES，2010，5417345HIRAKAWAN，OKAUCHIR，MIURAY，ETA1BIOSCIBIOTECHBIOCHEM，2005696536CASALS，OHVEIRAMB，FERREIRAMAFOODCHEM，2000，684817KNOPPS，BYTOFG，SELMARDEURFOODRESTECH，2006，2231958OOSTERVELDA，VORAGENAGJ，SCHOLSHACARBOHYDRATEPOLY，2003，541839BRUGGINKC，MAURERR，HERRMANNH，ETA1JCHROMATOGRA，2005，1085104IOPERRONED，DONANGELOCM，FARAHAFOODCHEM，2008，110103011LANGR，WAHLA，SKURKT，ETA1ANALCHEM，2010，824148612ZHUORJ，WANGL，WANGLX，ETA1CHINESEJOURNALOFCHROMATOGRAPHY卓荣杰，王莉，王龙星，等，色谱，2010，28437913S6NCHEZHERNNDEZL，PUCHA