TaKaRa定量PCR介绍

May20,2020,实时荧光定量PCR介绍,宝生物工程（大连）有限公司,主要内容,实时荧光定量PCR介绍,2,May20,2020,RealTimePCR基础知识,实时荧光定量PCR介绍,3,May20,2020,RealTimePCR的用途,实时荧光定量PCR介绍,4,May20,2020,RealTimePCR的原理,使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。,RealTimePCR,实时荧光定量PCR介绍,5,May20,2020,RealTimePCR的原理,同一个样品重复96次PCR的扩增曲线,实时荧光定量PCR介绍,6,May20,2020,RealTimePCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号值达到设定的阈值时所经历的循环数。(C-代表Cycle，t-代表threshold）,Ct值概念,阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。,RealTimePCR中的概念,实时荧光定量PCR介绍,7,May20,2020,在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程，最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。,RealTimePCR的原理,实时荧光定量PCR介绍,8,May20,2020,RealTimePCR检测系统-简介,实时荧光定量PCR介绍,May20,2020,LightCycler480,Rotor-gene6000,MiniOpticon,Mx3005PTM,LINE-GENEFQD-66A,ABIPRISM7500,iQ5Real-TimePCRDetectionSystem,TaKaRaTP800,实时荧光定量PCR介绍,May20,2020,各公司RealTimePCR检测系统比较,实时荧光定量PCR介绍,May20,2020,RealTimePCR基础知识,实时荧光定量PCR介绍,12,May20,2020,TaqManProbe,CyclingProbe,MolecularBeacon,etc.,SYBRGreenI,荧光染料嵌合法,荧光探针法,RealTimePCR的检测方法,实时荧光定量PCR介绍,13,May20,2020,荧光染料嵌合法（SYBRGreenI）,SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBRGreenI,实时荧光定量PCR介绍,14,May20,2020,F,SYBRGreenI法作用机理示意图,实时荧光定量PCR介绍,15,May20,2020,TaqMan法作用机理,TaqMan探针为一寡核苷酸，5端标记一个报告基团（Reporter），3端标记一个淬灭基团（Quencher）。,Q,实时荧光定量PCR介绍,16,May20,2020,TaqManProbe法原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,17,May20,2020,CycleavePCR法原理,Cyclingprobe为一寡核苷酸，一端标记一个荧光报告基团（Reporter），一端标记一个荧光淬灭基团（Quencher），寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。,RNaseH,实时荧光定量PCR介绍,18,May20,2020,CycleavePCR法原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,19,May20,2020,SYBRGreenI法与Probe法比较,常用于mRNA表达量分析等,SYBRGreenI法,简便易行,价格便宜,要求反应的特异性,不能进行多重PCR,常用于SNP解析，病毒、病源菌检测,实时荧光定量PCR介绍,20,May20,2020,主要内容,实时荧光定量PCR介绍,21,May20,2020,OneStep和TwoStepRT-PCR的选择,实时荧光定量PCR介绍,22,May20,2020,Two-StepRT-PCR,One-StepRT-PCR,One-StepRT-PCR,OneStep和TwoStepRT-PCR的选择,实时荧光定量PCR介绍,23,May20,2020,RTPrimer的选择,RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimer,Random6merPrimer,GeneSpecificPrimer,OligodTPrimer,PCRR-Primer,PCRF-Primer,实时荧光定量PCR介绍,24,May20,2020,RTPrimer的选择,实时荧光定量PCR介绍,25,May20,2020,TotalRNA中GenomicDNA混入的对策,PCRPrimer,exon,intron,exon,GenomicDNA,cDNA,exon,exon,PCRPrimer,RealTimePCR,RealTimeRT-PCR,SmallPCRProduct,SmallPCRProduct,此种情况必须采用DNaseI处理，去除基因组DNA。,融解曲线分析,实时荧光定量PCR介绍,26,May20,2020,PCRPrimer,exon,intron,exon,GenomicDNA,cDNA,exon,exon,PCRPrimer,RealTimePCR,RealTimeRT-PCR,LongPCRProductorNoProduct,SmallPCRProduct,融解曲线分析,可以区分cDNA或者基因组DNA来源的扩增产物。,TotalRNA中GenomicDNA混入的对策,实时荧光定量PCR介绍,27,May20,2020,PCRPrimer,exon,intron,exon,GenomicDNA,cDNA,exon,exon,PCRPrimer,RealTimePCR,RealTimeRT-PCR,NoProduct,SmallPCRProduct,融解曲线分析,TotalRNA中GenomicDNA混入的对策,实时荧光定量PCR介绍,28,May20,2020,RealTimePCR引物设计,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。,RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同,=对引物设计要求严格,普通PCR引物,RealTimePCR引物,实时荧光定量PCR介绍,29,May20,2020,RealTimePCR引物设计原则,实时荧光定量PCR介绍,30,May20,2020,RefSeq序列,好的引物需要寻找好的参照序列,RealTimePCR引物设计,通过NCBI获得参考序列和相关情报。RefSeq数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。序列可信度高，信息量大,实时荧光定量PCR介绍,31,May20,2020,LOCUSNM_0087771959bpmRNAlinearROD15-APR-2005DEFINITIONMusmusculusphenylalaninehydroxylase(Pah),mRNA.ACCESSIONNM_008777VERSIONNM_008777.1GI:6679202SOURCEMusmusculus(housemouse)ORGANISMMusmusculusFEATURESLocation/Qualifiersgene1.1959/gene=Pah/db_xref=GeneID:18478/db_xref=MGI:97473CDS48.1409/gene=Pah/note=go_function:ironionbindinggoid0005506/protein_id=NP_032803.1/db_xref=GI:6679203/db_xref=GeneID:18478/db_xref=MGI:97473ORIGIN1aattcaaccctgtgctaagctagacacctcacttactgagagccagcatggcagctgttg61tcctggagaacggagtcctgagcagaaaactctcagactttgggcaggaaacaagttaca121tcgaagacaactccaatcaaaatggtgctgtatctctgatattctcactcaaagaggaag181ttggtgccctggccaaggtcctgcgcttatttgaggagaatgagatcaacctgacacaca241ttgaatccagaccttcccgtttaaacaaagatgagtatgagtttttcacctatctggata301agcgtagcaagcccgtcctgggcagcatcatcaagagcctgaggaacgacattggtgcca361ctgtccatgagctttcccgagacaaggaaaagaacacagtgccctggttcccaaggacca421ttcaggagctggacagattcgccaatcagattctcagctatggagccgaactggatgcag481accacccaggctttaaagatcctgtgtaccgggcgagacgaaagcagtttgctgacattg541cctacaactaccgccatgggcagcccattcctcgggtggaatacacagaggaggagagga601agacctggggaacggtgttcaggactctgaaggccttgtataaaacacatgcctgctacg661agcacaaccacatcttccctcttctggaaaagtactgcggtttccgtgaagacaacatcc721cgcagctggaagatgtttctcagtttctgcagacttgtactggtttccgcctccgtcctg781ttgctggcttactgtcgtctcgagatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccact841gcacacagtacattaggcatggatctaagcccatgtacacacctgaacctgatatctgtc901atgaactcttgggacatgtgcccttgttttcagatagaagctttgcccagttttctcagg961aaattgggcttgcatcgctgggggcacctgatgagtacattgagaaactggccacaattt1021actggtttactgtggagtttgggctttgcaaggaaggagattctataaaggcatatggtg1081ctgggctcttgtcatcctttggagaattacagtactgtttatcagacaagccaaagctcc1141tgcccctggagctagagaagacagcctgccaggagtatactgtcacagagttccgacctc1201tgtactatgtggccgagagtttcaatgatgccaaggagaaagtgaggacttttgctgcca1261caatcccccggcccttctccgttcgctatgacccctacactcaaagggttgaggtcctgg1321ataatactcagcagttgaagaatttagctgactccattaatagtgaggttggaatccttt1381gccatgccctgcagaaaataaagtcatgaacagaaagtgacgtcatagacagaacttagg1441aggtcaaccaaaaaaatctgctgatagaagtatagtaactgcttcttttccctgaagaag1501aaaagttttatttgcaatgtcagcttttaatatattttcctaacatagtggaggatcacc1561aaataaatcaatttctctgaatgaaagtatattaaaacccatcagtggtagatccttcag1621agtcacatttgatttagatatctcagaccttcaatttggtttaaaatgtaatttctcagt,GenBankfile,NM_008777,Musmusculusphenylalaninehydroxylase(Pah),mRNA.,RealTimePCR引物设计,实时荧光定量PCR介绍,32,May20,2020,1aattcaaccctgtgctaagctagacacctcacttactgagagccagcatggcagctgttg61tcctggagaacggagtcctgagcagaaaactctcagactttgggcaggaaacaagttaca121tcgaagacaactccaatcaaaatggtgctgtatctctgatattctcactcaaagaggaag181ttggtgccctggccaaggtcctgcgcttatttgaggagaatgagatcaacctgacacaca241ttgaatccagaccttcccgtttaaacaaagatgagtatgagtttttcacctatctggata301agcgtagcaagcccgtcctgggcagcatcatcaagagcctgaggaacgacattggtgcca361ctgtccatgagctttcccgagacaaggaaaagaacacagtgccctggttcccaaggacca421ttcaggagctggacagattcgccaatcagattctcagctatggagccgaactggatgcag481accacccaggctttaaagatcctgtgtaccgggcgagacgaaagcagtttgctgacattg541cctacaactaccgccatgggcagcccattcctcgggtggaatacacagaggaggagagga601agacctggggaacggtgttcaggactctgaaggccttgtataaaacacatgcctgctacg661agcacaaccacatcttccctcttctggaaaagtactgcggtttccgtgaagacaacatcc721cgcagctggaagatgtttctcagtttctgcagacttgtactggtttccgcctccgtcctg781ttgctggcttactgtcgtctcgagatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccact841gcacacagtacattaggcatggatctaagcccatgtacacacctgaacctgatatctgtc901atgaactcttgggacatgtgcccttgttttcagatagaagctttgcccagttttctcagg961aaattgggcttgcatcgctgggggcacctgatgagtacattgagaaactggccacaattt1021actggtttactgtggagtttgggctttgcaaggaaggagattctataaaggcatatggtg1081ctgggctcttgtcatcctttggagaattacagtactgtttatcagacaagccaaagctcc1141tgcccctggagctagagaagacagcctgccaggagtatactgtcacagagttccgacctc1201tgtactatgtggccgagagtttcaatgatgccaaggagaaagtgaggacttttgctgcca1261caatcccccggcccttctccgttcgctatgacccctacactcaaagggttgaggtcctgg1321ataatactcagcagttgaagaatttagctgactccattaatagtgaggttggaatccttt1381gccatgccctgcagaaaataaagtcatgaacagaaagtgacgtcatagacagaacttagg1441aggtcaaccaaaaaaatctgctgatagaagtatagtaactgcttcttttccctgaagaag1501aaaagttttatttgcaatgtcagcttttaatatattttcctaacatagtggaggatcacc1561aaataaatcaatttctctgaatgaaagtatattaaaacccatcagtggtagatccttcag1621agtcacatttgatttagatatctcagaccttcaatttggtttaaaatgtaatttctcagt1681tctcatcaacattcatcaaatttgggactcatatcatttgggctctgtctgttcattttt,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGGC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,RealTimePCR引物设计,实时荧光定量PCR介绍,33,May20,2020,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGGC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,-3,-3,-3,-3,SNP,3末端的T,3bp互补,RealTimePCR引物设计,实时荧光定量PCR介绍,34,May20,2020,RealTimePCR引物设计,31,实时荧光定量PCR介绍,35,May20,2020,RealTimePCR用TaqMan探针设计原则,RealTimePCR探针设计原则,实时荧光定量PCR介绍,36,May20,2020,探针荧光标记物的选择,实时荧光定量PCR介绍,37,May20,2020,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,PCR扩增效率（E）：0.8-1.2,35Cycles内可得到好的定量结果。如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。,相关系数（r2）：大于0.98,反应性能确认,实时荧光定量PCR介绍,38,May20,2020,标准Protocol955sec.6030sec.,B.有非特异性扩增时提高退火、延伸温度缩短退火、延伸时间降低引物浓度,PCR条件优化顺序,实时荧光定量PCR介绍,39,May20,2020,主要内容,实时荧光定量PCR介绍,40,May20,2020,标准曲线制作,扩增曲线,标准曲线,标准品梯度的选择：56个梯度标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为5-10,105104103102101100,105104103102101100,实时荧光定量PCR介绍,41,May20,2020,标准品的种类,实时荧光定量PCR介绍,42,May20,2020,质粒标准品的构建,紫色部分为RealTime引物区,红色部分为标准品构建用引物区,质粒标准品引物设计,AGTACCTAGATCCTAG,AGTACCTAGATCCTAG,实时荧光定量PCR介绍,43,May20,2020,质粒标准品构建流程,基因组DNA,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。,实时荧光定量PCR介绍,44,May20,2020,RNA标准品构建,紫色部分为RealTime引物区,红色部分为标准品构建用引物区,蓝色部分T7启动子和Poly(T),实时荧光定量PCR介绍,45,May20,2020,体外转录RNA标准品构建流程,RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。,T7RNApolymerase,体外转录RNA,TotalRNA,PCR,cDNA,RT,T7Promoter,TTTTT,PCR产物,目的基因,目的基因,目的基因,AAAAA,AAAAA,实时荧光定量PCR介绍,46,May20,2020,理想的标准品扩增曲线,基线平整NegativeControl为水平线指数区较明显，陡度大平台区汇于一起线性范围宽,实时荧光定量PCR介绍,47,May20,2020,理想的标准曲线,相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。,扩增效率,相关系数,扩增效率（E）计算方法,标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时E=10-1/a-1标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10)E=10-a-1,实时荧光定量PCR介绍,48,May20,2020,RealTimePCR解析方法,实时荧光定量PCR介绍,49,May20,2020,融解曲线分析,Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。,SYBRGreenI法进行检出时，要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。,实时荧光定量PCR介绍,50,May20,2020,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对PCR产物特异性进行分析,融解曲线分析,实时荧光定量PCR介绍,51,May20,2020,RealTimePCR解析方法,实时荧光定量PCR介绍,52,May20,2020,绝对定量解析方法,提取样品,引物设计,标准品制备,RealTimePCR反应,数据分析,流程,实时荧光定量PCR介绍,53,May20,2020,绝对定量解析方法,通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。,105,104,103,101,扩增曲线图,标准曲线图,检测样品,检测样品,102,实时荧光定量PCR介绍,54,May20,2020,相对定量解析方法,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。,进行相对表达量分析必要性,实际上目的基因表达量分析,实时荧光定量PCR介绍,55,May20,2020,相对定量解析方法,管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、-actin等。,筛选方法,根据文献提供通过具体实验筛选,实时荧光定量PCR介绍,56,May20,2020,相对定量解析方法,通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后以管家基因的定量结果为依据对目的基因进行比值校正，求得相对值即为相对表达量。,相对值=,校正值=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,检测样品的校正值,对照样品的校正值,通过对照样品、检测样品的目的基因及管家基因的Ct值，然后以管家基因的Ct值为依据对目的基因进行差值校正，最终求得相对表达量。,双标准曲线法,Ct法,相对值=2,-Ct(目检-管检)-Ct(目对-管对),实时荧光定量PCR介绍,57,May20,2020,主要内容,实时荧光定量PCR介绍,58,May20,2020,定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析,实时荧光定量PCR介绍,59,May20,2020,SNP解析原理示意图,实时荧光定量PCR介绍,60,May20,2020,CyclingProbe法,PCR-RFLP法,ROX,FAM,ROX、FAM通道均有信号检出,Eco57ICTGAAG(N)16GACTTC(N)14wildtype:切断Mutanttype:不切断,ROX,FAM,Mutant,wild,ROX通道有信号检出,FAM通道检出荧光信号,ROX,FAM,杂合型(hetero),野生型(wildhomo),突变型(mutanthomo),定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析,实时荧光定量PCR介绍,61,May20,2020,定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析,提取样品,引物、探针设计,RealTimePCR反应,数据分析,流程,实时荧光定量PCR介绍,62,May20,2020,从人血液中（共计10个样品）提取基因组DNA。,样品提取,提取试剂：BloodGenomeDNAExtractionKit(D9081),定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析,定量反应,反应试剂：CycleavePCRCoreKit(DCY501),实时荧光定量PCR介绍,63,May20,2020,实验结果,Allele1:突变型,Allele2:野生型,定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析,Hetero:杂合型,实时荧光定量PCR介绍,64,May20,2020,绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,检测方法TaqManprobe法检测样品3个从SARS病毒培养液中提取的GenomicRNA目的基因SARS病毒RNA内参SARSInternalControlRNA标准品SARSControlRNA试剂OneStepPrimeScriptRT-PCRKit（PerfectRealTime）（DRR064）仪器SmartCycler,实时荧光定量PCR介绍,65,May20,2020,pBluescriptIISK(+)Vector,T7Promoter,SARSControlRNA构建,绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,66,May20,2020,纯化的SARSControlRNAOD值测定结果,体外转录的SARSControlRNA电泳照片,M1M2,M1:-HinddigestM2:DL2,000Marker,DNaseI处理前,DNaseI处理后,绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,67,May20,2020,DNA,T7Promoter,SARSInternalControlRNA的构建,pBluescriptIISK(+)Vector,绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,68,May20,2020,体外转录的InternalControlRNA电泳照片,M1:-HinddigestM2:DL2,000Marker,纯化的SARSInternalControlRNAOD值测定结果,M1M2,DNaseI处理前,DNaseI处理后,绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,实时荧光定量PCR介绍,69,May20,2020,探针的选择,绝对