EASY克隆技术A

EASY 克隆技术,北京全式金生物技术有限公司,EASY 克隆,分子克隆的传统方法Topoisomerase (EASY)克隆原理EASY 克隆策略EASY 克隆成功的关键EASY 克隆常见问题及解决方法,Some slides are copied from several web sites. Thanks to all of these unknown contributors!,分子克隆的传统方法,分子克隆的传统方法,常规的连接是一个三分子共同反应的过程。 TA克隆中粘性末端仅有一个碱基，因此较高的DNA浓度和较高T4连接酶浓度是获得较高连接效率的前提。,Vaccina Topoisomerase as Cloning Tool,1. Specific DNA cleavage and binding by vaccinia virus DNA topoisomerase IS Shuman and J Prescott J. Biol. Chem., Vol. 265, Issue 29, 17826-17836, Oct, 1990,2. Site-specific interaction of vaccinia virus topoisomerase I with duplex DNA. Minimal DNA substrate for strand cleavage in vitroS Shuman J. Biol. Chem., Vol. 266, Issue 17, 11372-11379, Jun, 1991,3. Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomeraseS Shuman J. Biol. Chem., Vol. 269, Issue 51, 32678-32684, 12, 1994,EASY 克隆原理,连接反应成为一个双分子作用的过程!,比较传统TA载体和Topo载体的稳定性、自连率,EASY 克隆,利用 Vaccina Virus Topoisomerase (TOPO) ，与载体结合 (牛痘病毒的拓扑异构酶)酶特点： 由314个氨基酸组成 识别5-C/TCCTT-3 同时具有限制性内切酶(nick enzyme)和连接酶的功能; 工作所需缓冲液条件宽泛 不需要外界提供能量 80%的连接反应在2分钟之内即可完成,EASY 克隆过程: 三个简单步骤,制备PCR产物,1. 1 ml TOPO载体 + 1 ml PCR产物,2. 室温孵育5分钟,3. 转化,EASY 克隆策略对片段的处理,EASY克隆策略对比载体EASY 克隆和T4 DNA Ligase克隆比较（Topo载体和普通TA载体比较）,零背景克隆载体,零背景克隆载体 通过自杀基因表达与否筛选阳性重组子。 当载体与片段连接成功，自杀基因无法正确表达，包含重组子的细胞可以正常生长。 当载体与片段连接不成功，自杀基因正确表达，包含载体的细胞无法生长，即“Zero”背景。 快速：仅需要5分钟反应时间； 简单：只需加入片段即可； 高效：阳性率接近于100%； 无需蓝白斑筛选； 适用于长片段克隆 目前已成攻的最长片段为10 Kb！,原核表达载体,哺乳动物表达载体,EASY 克隆成功的关键,引物设计、PCR条件克隆反应设置克隆感受态细胞的选择选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒,（一）准备外源片段时的注意事项 引物设计：引物不能磷酸化。 PCR注意事项： 后延伸设置为721020分钟. 目的： 保证扩增片段完整,可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时,该步骤为加A反应； Taq系列DNA聚合酶扩增(如EasyTaq, TransTaq-T等), 使用TA克隆载体； Pfu系列DNA聚合酶扩增(如EasyPfu, FastPfu等)， 使用Blunt克隆载体； 复合DNA聚合酶(如TransHiFi, LA等)扩增， 使用TA载体, 也可用Blunt载体。 (一般推荐用TA载体,使用Blunt载体时克隆数较少)。,（二）克隆反应设置连接时的注意事项摩尔比: EASY 克隆DNA的工作浓度广泛。 通常产物在琼脂糖胶上可见时，加入1 l 即可。 优化指南：如果按照上述操作未得到理想结果, 请按照以下具体要求调整： 1 kb 左右的片段: 20 ng DNA 2 kb 左右的片段: 40 ng DNA 3 kb 左右的片段: 60 ng DNA 可按“1Kb加入20ng”计算，如1.5Kb加入30ng 片段加入的最大量: 4 ml, 浓度很低时也有一定的连接效率， 体积大于5 ml 会破坏反应体系平衡. 片段加入的最小量: 0.5 ml, 浓度非常高时需要稀释, 否则易形成串连体反应温度：Topo的工作温度为2037，最适反应温度为25反应时间： 530分钟,克隆感受态细胞的选择,（三）其它注意事项基因特殊结构：Why: 具有高AT, 高GC, 反向重复序列的基因, 不容易连接Suggestion: 调整, 摸索连接体系和条件； 尝试不同的载体, （不同的骨架对片段偏好性不同）,EASY 克隆常见问题及解决方法,克隆数少 (感受态细胞效率正常范围内)菌落多为淡蓝色或 Fish Eye (白边蓝芯)克隆阳性率低PCR鉴定重组子失败,1. 克隆数少,PCR产物不新鲜 DNA浓度低 胶回收片段 基因特殊结构 毒基因 载体过期,（1）PCR产物不新鲜： Why: 3-A 容易脱落, 导致T/A克隆效率低 Suggestion: PCR产物立即使用效果最好; 或将PCR产物置于4，保存12天内使用; 不要冷冻PCR产物,（2）目的片段浓度很低： Why:无法保证有效碰撞 Suggestion: 浓缩DNA,Why: EB和紫外照射（UV短波长）对dsDNA造成损伤导致克隆效率降低, 阳性率减少, 突变率增加 (EB nicks DNA when exposed to light, which is promoted by shorter UV wavelengths, increased light intensity, and increased exposure)Suggestion: *使用新鲜电泳液 *尽量减少紫外照射时间 *不用短波紫外线(254 nm), 用长波紫外线(366 nm) (multiband transluminator or hand-held long-wave UV lamp) *使用EB替代染料但替代品会使迁移率发生变化,（3）克隆胶回收片段,*Most translumonators use 302 nm,Gel stained with EB (for UV Light) or SYBR Green I (for Blue Light),紫外照射降低克隆数,紫外照射降低克隆数,照射02min，SYBR+Blue Light：克隆数几乎无变化EB+UV 254nm：锐减,紫外照射减少克隆阳性率,增加克隆突变率,（4）毒基因： Why: 其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 Suggestion: 选用正确的载体 使用Top10 鉴定不同大小的克隆,2. 菌落多为淡蓝色或 Fish EyeWhy: 插入片段没有影响LacZ基因读码框a. 插入片段小(小于400 bp）b. 插入片段的结构特殊Suggestion: 不要丢弃平板！进行进一步鉴定,3. 克隆阳性率低 (or 多数克隆不正确),175 ng/band,阳性率低:有引物二聚体（且碱基数为三的倍数）,多数克隆不正确: 有杂带等,4. PCR鉴定重组子失败 用GSP引物鉴定时没有条带；用通用引物鉴定时, 扩产物既无目的带又无载体自连带；Suggestion: 预变性9510 min(彻底裂解菌体、释放DNA)最好用通用引物鉴定（可判断症结）,基因定点突变,利用PCR实现点突变的传统方法QuickChange , GeneTailor，Easy /Fast Mutagenesis System三种点突变试剂盒的比较,传统方法:,QuickChange , GeneTailor, Easy/Fast Mutagenesis System是基于PCR原理实现点突变, 它们与传统方法的区别主要在于可以对突变克隆进行初步的筛选筛选原理：降解甲基化质粒模板筛选依据： 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化； PCR产物没有甲基化。,筛选方法 体外切割： DpnI 识别序列5-GmATC-3 (在 DNA序 列中, 一般每256 bp 出现一次). 甲基化模 板可被 DpnI 识别、切割，而扩增产物 (发生突变的产物)不会被切割。 体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒 的大肠杆菌(DH5-T1，即DMT)降解, 而扩增产物(发生突变的产物)不会被降解。,Stratagene：QuickChange Mutagenesis System,优点： 仅以原始DNA作为模板，有效降低了错配的机率（意义：下页表格） 筛选方法：DpnI 切割甲基化模板 不需使用特定的菌株进行转化 缺点： 要求引物纯化方式为HPLC/PAGE纯化 引物完全重叠, 线性扩增, 产物不可见, 可操作性差 扩增产物为线状, 转化效率低 DpnI 切割模板DNA，而非消化DNA,* PCR条件对错配率有明显的影响（酶、dNTPs以及镁离子浓度，等等）。,Invitrogen：GeneTailor Mutagenesis System,优点: 引物部分重叠, 指数扩增 引物无需特殊纯化 扩增产物可见, 易于操作 筛选方法：DH5-T1体内降解 缺点： 突变点在一条引物上 高GC的质粒不适合作为模板 转化需要特定的感受态细胞,TransGen: Easy/Fast Mutagenesis System, 引物部分重叠, 指数扩增. 两条引物上均有突变点, 高突变率. 双重筛选: DpnI 体外降解 + DMT体内降解.,TransGen: Easy/Fas