白血病分子诊断技术(咸阳)（课堂PPT）

白血病分子诊断技术,康圣环球医学特检集团周荣,技,WH0血液肿瘤分类方案（1999年）,新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定疾病的“真实本质”。提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。,形态学,免疫学,细胞遗传学,技术支持：800-810-0579,WH0血液肿瘤分类方案（2008年）,组织,蛋白,细胞,基因,技术支持：800-810-0579,白血病分子诊断的意义,精确诊断准确预后指导治疗科研资料,白血病初发,MICM诊断,系统诊断,异常标记,残留监测,靶向治疗,技术支持：800-810-0579,WHO血液肿瘤新分类实验技术平台,实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生物学实验技术平台以及更为重要的掌握这类实验技能并具有血液肿瘤专业知识的血液病理学医师。,遗传工作站,流式细胞,基因平台,技术支持：800-810-0579,基因检测融合基因基因突变,技术支持：800-810-0579,“二次打击”学说,D.GaryGillilandBestPractice16:409-417,基因突变,融合基因,白血病发生,技术支持：800-810-0579,CMLIndicationsforDiagnosticTestsMilestonesandMonitoringinPatientswithCMLTreatedwithImatinib(2008ASHEducationProgramBookp420)TestIndicationPhysicalExamDiagnosis/StagingEverythreemonthuntilresolutionofsplenomegalySuspectedprogressionorresistanceCompleteBloodCountDiagnosis/StagingEvery1-2weeksuntilbloodcounthavestabilized,thenat6weeksintervalsSuspectedprogressionorresistanceBoneMarrowKaryotypingDiagnosis/Staging6,12,18monthsoruntilcompletecytogeneticresponseSuspectedprogressionorresistanceQuantitativePCRforBcr-AblEverythreemonthsonceCCyR(completecytogeneticresponse)documentedFISHforBCR-ABLUncertainDiagnosis(typicalclinicalpresentation,butmetaphase(peripheralblood)cytogeneticsnotsuccessful,orPhchromosomenegative)Every3monthsifnoaccesstohighquantitativePCRmonitoringQualitative(lowsensitivity)UncertainDiagnosis(typicalclinicalpresentation,butmetaphasePCRforBCR-ABLcytogeneticsnotsuccessful,orPhchromosomenegative)BCR-ABLKinaseMutationScreenSuspectedprogressionorresistance,技术支持：800-810-0579,MolecularMeasurementsofTreatmentResponseClinicalApplication(2008ASHEducationProgramBookp367)ApplicationActionDetectpoorearlytreatmentresponseTreatmentintensificationDetectgoodearlytreatmentresponseTreatmentdeintensificationDetectrelapseTreatmentintensificationPrepareforHSCTMeasureMRDbeforeHSCTOptimizetimingofHSCTMeasureMRDafterHSCTModulateimmunosupressionDLI,etc.MeasureMRDatendofclinicaltrialEvaluatetheresultofnovelanti-ALLagentsortherapy,技术支持：800-810-0579,分子诊断在白血病诊断中的应用,提供早期辅助诊断及预后判断对治疗过程进行跟踪进行白血病治疗后的微小残留检测,技术支持：800-810-0579,各病例中的具体应用,AMLCMLALLCLL淋巴瘤,技术支持：800-810-0579,AML病例中应用,t(8;21)(q22;q22)AML1-ETOt(15;17)(q22;q21)PML-RARainv(16)(p13;q22)CBFB-MYH11AML融合基因全套检测FLT3基因突变检测NPM1基因突变检测c-kit/D816V突变检测CEBPA基因突变检测WT1基因表达定量检测,技术支持：800-810-0579,t(8;21)(q22;q22)AML1-ETO融合基因,t(8;21)出现在大约7%的AML病例中，在年青的患者中更为常见。其主要出现在AML-M2这一亚型中，大约有20-40%的病例具有t(8;21)。AML1-ETO融合基因出现在所有的t(8;21)阳性的AML中，同时也出现在具有复杂易位的t(8;21)阴性的AML病例中。t(8;21)易位是一个较好的标志。,技术支持：800-810-0579,技术支持：800-810-0579,PML-RAR,APL是一类临床凶险的急性白血病，常见广泛的严重的出血，以颅内出血最为严重。1、t（15;17)，是APL特有的遗传学标志。（70%-90%的APL存在）2、由于PML基因上融合位点的不同，分为bcr1(55%)、bcr2(4%)、bcr3(40%)三种融合型。3、PML-RARa融合基因（+）的患者，可使用全反式维甲酸并提示预后复发。该基因阳性的病人，可用于疗效监测和微小残留的检测。,技术支持：800-810-0579,技术支持：800-810-0579,inv(16)(p13;q22)CBFB-MYH11融合基因,Inv(16)(p13;q22)或t(16;16)(p13;q22)通常见于AML-M4Eo亚型，占总AML患者的10%。inv(16)(p13;q22)的病人通常有较好的预后。,技术支持：800-810-0579,技术支持：800-810-0579,AML相关基因全套筛查,技术支持：800-810-0579,技术支持：800-810-0579,基因突变检测AML患者预后判断C-Kit、FLT3、NPM1、CEBPA,染色体核型正常的AML患者,CEBPA(15%),技术支持：800-810-0579,MolecularMarkersadditionaltocytogeneticswithindependentprognosticsignificancesasregardingremissiondurationorsurvivalinAMLofadultsAML:ChallengeofCapturingDieseaseVariety(2008ASHEducationProgramBookp3)PrognosisGeneGenemutationwithCEPBAmutfavorableimpactNMP1mutbutFLD3-ITDnegGenemutationwithKITunfavorableimpactFLD3-ITDbutnoNMP1mutMLL-PTD*(5-10%ofnormalkaryotypeAML)WT-1*amongnormalkaryotypeAML,技术支持：800-810-0579,AML患者4种基因突变检测小结,技术支持：800-810-0579,WT1定量检测MDS/AML监测指标,WT1基因在AML和MDS病人中经常异常高表达，与AML和MDS的发生和进展，以及凶险判断，疗效跟踪和预后复发判断有非常密切的关系。通过定量PCR检测WT1的表达能够有助于AML和MDS病人的风险判断，疗效跟踪和预后复发的判断。,技术支持：800-810-0579,技术支持：800-810-0579,WT1在正常标本和AML病例中的表达情况,正常骨髓,患者骨髓,技术支持：800-810-0579,技术支持：800-810-0579,基因检测CMPD诊断,技术支持：800-810-0579,在WHO2008分类系统中，将有无JAK2突变列为主要的诊断指标：如果JAK2突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红系细胞明显增加，就可以诊断真性红细胞增多症（PV），即使患者就诊时血红蛋白低于以往WHO所规定的指标值，但却持续超过正常值20g/l，也可以确诊PV。如果JAK2突变阳性，血小板仅仅持续大于450*109/L，骨髓巨核细胞增生，可以诊断原发性血小板增多（ET）。,PV/ET诊断,技术支持：800-810-0579,FIP1L1-PDGFRA部分高嗜酸性粒细胞综合征（HES）患者含有FIP1L1-PDGFRA融合基因，FIP1L1-PDGFRA有持续活化的酪氨酸激酶活性，对酪氨酸激酶抑制剂非常敏感，可用格列卫治疗。ETV6-PDGFRB有少部分CMPD病例（BCR-ABL阴性）的PDGFRB基因持续性活化表达，格列卫能够特异性的抑制ETV6-PDGFRB的酪氨酸激酶活性，携带该融合基因的CMPD病例可以选择格列卫治疗。,技术支持：800-810-0579,CML病例中的应用,BCR-ABL融合基因检测：t(9;22)(q34;q11)BCR-ABLp210t(9;22)(q34;q11)BCR-ABLp230BCR-ABL融合基因ABL激酶突变检测,技术支持：800-810-0579,BCR-ABL融合基因,超过95%的CML病例中存在BCR-ABL融合基因P210型M-bcr（绝大多数）b3-a2（55%）b2-a2（40%）b3-a2和b2-a2（5%）b3-a3（罕见）b2-a3（罕见）p230型u-bcre19-a2（罕见）,技术支持：800-810-0579,定性检测：RT-PCR,定量检测：QRT-PCR,技术支持：800-810-0579,定性检测报告模板,技术支持：800-810-0579,定量检测报告,技术支持：800-810-0579,BCR-ABL融合基因ABL激酶突变检测,ABL激酶突变会引起伊马替尼治疗耐药T315I耐药机制:T315突变后不能与伊马替尼形成关键性的氢键，可完全阻断伊马替尼与ABL激酶区的结合,从而耐药。P环的突变(244-255)耐药机制：如Y253FH、E255KV、Q252H、G250E等通过改变ABL激酶的空间构象，亦可阻碍伊马替尼与之结合。,技术支持：800-810-0579,A环突变(381-402)一般提高用药量可以降低耐药程度。其它突变对于耐药程度较弱的突变，如M244V、G250E、F317L、E355G、F359V及V379I等，通过提高药物剂量，可以克服耐药。,技术支持：800-810-0579,报告模板,技术支持：800-810-0579,ALL病例中应用,t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1t(9;22)(q34;q11)BCR-ABLALL相关基因全套检测,技术支持：800-810-0579,t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1融合基因,t(1;19)(q23;p13)易位可以在5-6%的儿童ALL病例和3%的成人ALL病例检测到。这一易位几乎全部出现在前B细胞ALL病例中。携带有该易位的病人，其临床症状都比较凶险。,技术支持：800-810-0579,t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因,在50-70%的婴幼儿ALL和将近5%的小儿和成人ALL病例中有MLL-AF4融合基因。t(4;11)(q21;q23)与前B-ALL相关。在婴幼儿ALL中MLL-AF4融合基因被认为是预后不好的标志。在成人ALL中也是一个坏的标志，但对于成人ALL，该融合基因的存在似乎能增强高剂量的阿糖胞苷（Ara-c）的疗效。,技术支持：800-810-0579,t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1融合基因,t(12;21)(p13;q22)是儿童ALL中最为常见的易位，几乎25%的小儿ALL有该易位。其主要的阳性病人出现在1-12岁之间，其中2-5岁这个年龄段最多。所有的病例其免疫分型都是前B细胞ALL。t(12;21)阳性的病人都有较好的预后，其复发的时间也会较晚。,技术支持：800-810-0579,t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL融合基因,Ph染色体在5%的小儿ALL和20-50%（随年龄增加比例也增加）的成人ALL中也可见。在Ph+的ALL中40%的BCR-ABL融合基因是p210型的，60%是p190型的。在ALL中，PH阳性和随之出现的BCR-ABL融合基因是一个非常不好的标志。,技术支持：800-810-0579,ALL相关基因全套检测,44,技术支持：800-810-0579,CLL病例中的应用,IgVH基因重排检测：IgVH突变状态：按照细胞IgVH的突变状态可以将CLL分为突变的CLL（M-CLL）与未突变的CLL(U-CLL)。前者预后较好。而后者则疾病进展快，生存期短。,技术支持：800-810-0579,IgVH基因重排阳性的CLL患者预后较好,技术支持：800-810-0579,融合基因套系,技术支持：800-810-0579,白血病31种融合基因筛查,技术支持：800-810-0579,其它检测项目,TCR/IgH重排BCL-1/JH、BCL-2/JH检测,技术支持：800-810-0579,IGH与TCR重排,淋巴细胞克隆性的检测对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值。,单克隆重排：淋巴细胞异常标志多克隆性重排：淋巴细胞正常生长发育,IgH基因,TCR基因,T细胞,B细胞,重排,成熟B细胞,成熟T细胞,技术支持：800-810-0579,ALL、CLL、淋巴瘤辅助诊断CLL预后判断,技术支持：800-810-0579,ALL、CLL、淋巴瘤辅助诊断,技术支持：800-810-0579,BCL-1/JH检测,BCL-1/JHt(11;14)(q13;q32)基因重排主要发生在套细胞淋巴瘤（MCL）当中,在60-70%的MCL病例中有该易位的存在，检测BCL-1/JH基因重排可帮助鉴别诊断套细胞淋巴瘤。,技术支持：800-810-0579,技术支持：800-810-0579,BCL-2/JHt(14;18)易位是B细胞淋巴瘤的特有性变异，90%的滤泡性淋巴瘤和20-30%的弥漫性大B细胞淋巴瘤含有此易位。,BCL-2/JH检测,技术支持：800-810-0579,技术支持：800-810-0579,标本要求,骨髓2-3ml或外周血3-5mL（复发和微小残留的检测：骨髓2-3ml）EDTA抗凝（紫头管），4，24h内送检。,技术支持：800-810-0579,细胞遗传学染色体核型分析FISH,技术支持：800-810-0579,染色体核型分析,适应症1.造血系统疾病初诊2.末次化疗结束两周以上意义对恶性血液病的诊断，分类分型，治疗方案选择，疗效评估和预后预测方面都有重要的价值。,46，XY,技术支持：800-810-0579,t(9;22)(q34;q11),约占95%CMLPh染色体,染色体核型分析诊断,技术支持：800-810-0579,8三体单独或附加异常，较多见于M1，M4，M5，预后差或中等,46,XY,+8,技术支持：800-810-0579,FISH检测,荧光标记的DNA探针,原位杂交,荧光显微镜检测,技术支持：800-810-0579,FISH相对于染色体检测，灵敏度高，特异性高。可以弥补染色体不足，染色体检测为阴性，FISH可能为阳性。患者用药后，染色体阳性率较低，FISH可提高检出率。,染色体核型与FISH,技术支持：800-810-0579,变异型h（复杂遮蔽型）易位,FISH探针：BCR/ABL,检测