肿瘤分子诊断技术

肿瘤的分子诊断技术,温州医学院检验医学院生命科学学院,癌症的分子诊断,几乎癌组织都是克隆性增殖患者的所有癌细胞都起源于单一的癌细胞大多数癌症不能用单基因遗传方式解释某些类型的癌症，亲属发生同类肿瘤的风险会增加，但不表现孟德尔遗传许多癌症与环境的物理化学因子或生物因子有关,造成癌症的因素列举,细胞周期的调控因素受细胞周期素及相对应的细胞周期素依赖激酶 (cyclin-dependent kinase，CDK)严格调控细胞胞周期的每阶段都有一组 CDKs与cyclins 交互作用来调控CDK的磷酸化及cyclin-CDK抑制剂(CKIs)的活化都会影响细胞周期,癌症相关基因,致癌基因(oncogene) 1911年Rous发现的鸡的肿瘤传染因子是一种病毒，为反转录病毒癌化作用是因為病毒基因组内特殊致癌基因(v-onc) 哺乳类的基因组上，也存在有同源的序列 (e-onc) 调控胚胎的发展、细胞的增殖、分化和凋亡调控失常，会使细胞发展为恶性表型，正常细胞中具有这样潜能的基因称为原(致)癌基因( proto-oncogene),原(致)癌基因调控生长分化、信号传递、转录因子、细胞周期 生长因子病毒来源的sis基因与细胞来源的原癌基因-血小板衍生性生长因子次单位细胞表面生长因子受体表皮生长因子受体基因( epidermal growth factor receptor， EGFR)集落刺激因子1受体(CSF1R)基因相当， CSF1R是一种促进骨髓中多种细胞分裂的生长因子,细胞内信号传递系统( Intracellular signal transduction systems)RAS家族是信号传递通路G-protein的成份，藉由跨膜蛋白与Gprotein的结合将信号传至核内蛋白质-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是细胞内信号传递蛋白与信号传递至核内有关核内转录因子 MYC是DNA结合蛋白，而JUN是转录因子细胞周期有关的蛋白调控细胞周期相关的激酶和激酶抑制物,病毒性癌基因只有少数人类反转录病毒引起人类癌症HIV 可以促进细胞增殖和增加体细胞突变的机会，或插入基因组促使邻近基因活化引起免疫缺陷而间接促进肿瘤的产生病毒癌基因插入宿主癌化的原因有些的癌基因产物作用如同细胞癌基因产物有时插入的病毒癌基因是断裂的，這些断裂的序列可能是基因内的调控序列有些病毒癌基因的产物与细胞癌基因产物共存，可能调节癌蛋白活化,肿瘤抑制基因( tumor suppressor gene) 在遗传学上，癌基因对细胞的作用是显性作用( dominant effect) 可抑制oncogene作用的基因，称tumor suppressor gene 抑癌基因的蛋白產物能抑制细胞不正常生长及抑制细胞癌化遗传学上一般属于阴性 ( recessive)RB基因视网膜母细胞瘤( retinoblastoma，RB)，一种侵犯幼儿视网膜膜的肿瘤散发性非遗传的类型最常见，会造成单侧眼睛病变约1/3的RB病人产生多发性肿瘤，且常造成双眼的病变，及在同胞兄弟姊妹中可发生同样病变，家族倾向遗传性,RB基因的功能蛋白产物pRb是细胞周期的刹车器pRb 蛋白发生周期性的磷酸化反应pRb蛋白在GI期是细胞周期抑制信号的集合点，这个以pRb蛋白为中心的抑制传导途径，称为RB传导途径静止的细胞， pRb没有磷酸化Gl期之末，在有丝分裂时间是磷酸化的非磷酸化的pRb在进入S期之前可与几种蛋白质结合调控细胞周期,p53基因抑制肿瘤生长的作用，基因定位在17p ， p53是其分子量(53 kD)在人类的大肠癌中有70%因失去 p53功能50%的肺癌、40%的乳癌也因p53去活化而诱发人类癌症约有一半起因于p53突变缺陷或失去作用发生突变的蛋白质可能原因两个alleles都发生缺失一个allele上发生错义点突变，会抑制另一个正常野生型基因的功能,正常细胞中，p53的量都很低DNA损伤时，p53就大量增加，造成生长的停止或细胞凋亡( apoptosis)p53就激活p21蛋白质关闭细胞周期p21蛋白质是一个CDK 的抑制因子可结合CDK2、CDK4、CDK6，并抑制它们的活性细胞进入S期以前，得以修护受损伤的DNA若细胞已将进入S期，已不能修护受损伤的DNA，则p53起动细胞凋亡这二种功能保持基因组的稳定性，p53称为基因组保护者(guardian of genome),癌症有关的现象 染色体不稳定性癌化的细胞中常见到三倍体和单倍体染色体的缺失，还有染色体大片段的重排(插入、重复、缺失、倒转、易位) 染色体之间或染色体本身的交互作用，可能也参与了细胞基因表达的调控利用FISH相关技术检测染色体不稳定性 多色荧光FISH (multifluor-FISH) DNA结构不稳定 微卫星不稳定定 异质性丢失,细胞间期可表现特征性的ABL-BCR融合基因,微卫星不稳定MSI 正常组织STR相比较，出现STR重复次数的增加或减少，得到不一样的pattern Microsatellite DNA markers广泛使用在检测肿瘤初期基因组不稳定现象 Mao et al.(1996)，使用microsatellite analysis检测膀胱癌的尿沉淀物，有95%的检出率杂合性性丢失( loss of heterozygosity、LOH) 来自父系或母系的同一区域的DNA，有多形性的变化(如 SNP、STR、VNTR) ，但並不改变该区域基因的功能，称异质性的变化 癌化过程丧失此多形性的变化称之，此位置常是抑癌基因的所在,PCR扩增及电泳后同一个体的肿瘤组织与正常组织电泳带相比较，有两个以上的位点出现电泳带的增加、减少或移位者就诊断为MSI阳性。,DNA甲基化与癌症人体大约有一半的基因含有CpG islands尤其是持家基因和组织特异性表现的基因与正常细胞比较，DNA的甲基化在癌细胞上显示出甲基化型式的异常肿瘤抑制基因与癌相关基因CpG岛高度甲基化，癌基因及重复序列低度甲基化,检测LOH (Loss of heterozygosity )染色体基因不正常代表着整个片段基因的缺失或获得这片段可能在肿瘤发生有关的基因区域p53、APC基因位置的LOH利用毛细管电泳泳CE检测,箭头所指表示肿瘤的LOH现象,检测MSI (microstatellite instability )也可以说是复制差错(replication error)，导致寡核苷酸重复序列长度的改变使肿瘤细胞基因组不稳定而降低整体细胞忠实复制DNA的能力,蛋白质截短检测(protein truncation test， PTT ) 检测蛋白质层次上的突变造成蛋白质翻译后缩短蛋白的原因单个碱基的插入缺失产生一个stop codon的无义突变或移码突变(frameshift mutation)剪接位点的插入缺失造成剪接位点的改变,基因芯片在癌症的应用 人类p53基因位于第17号染色体短臂13区1带(17p13.1)上全长为20 kb 由11个exon和10个intron组成，编码393氨基酸90%以上的点突变位点发生在相对保留的第5-8 exon上突变热点集中在密码子273、 175、248、245、249、282等位点上因p53突变位点复杂， Affymetrix公司将p53基因exon 5-8可能的突变位点全部点在晶片上，构建一个p53 GeneChip,将肿瘤基因的扩增产物利用标志(绿色)与芯片杂交从杂交结果上看杂交探针所出现荧光信号，最亮点表示所测出的碱基参照正常野生型这个位点的碱基，就可知有沒有点的突变,微小残癌的检测( minimal residual disease， MRD)当恶性肿瘤经过治疗后，有时会有残留的癌细胞做细胞 FISH的分析，或者使用流式细胞分析利用外周血液及定量PCR的方法来检测有明确特异性位点的基因突变或染色体重排检测血中转移的腺癌，鳞状上皮癌等非血液的肿瘤,启